UNIDAD V

TÉCNICAS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR BIOTECNOLÓGICO

Objetivo educacional

Conocer y describir la importancia y los alcances de la ingeniería genética así como sus principales métodos.

5.1. Técnicas basadas en PCR y/o electroforesis

Las técnicas moleculares actuales han sido desarrolladas, en solo pocos años de investigación académica básica en muchos campos de la ciencia, de tal manera que en los últimos años, seis de éstas técnicas han surgido como los métodos para el análisis y tipificación de los aislamientos bacterianos.

Ellas son la huella dactilar de plasmidos o PF, el análisis de endonucleasas de restricción de ADN de plasmidos o REA; el análisis de endonucleasas de restricción de ADN cromosómico utilizando enzimas de corte y electroforesis convencional; el Polimorfismo de largos fragmentos de restricción o RFLP utilizando análisis de pruebas de ADN; La electroforesis en gel de campos pulsantes o PFGE; y el AP-PCR y otras técnicas relacionadas con la tipificación basada en la amplificación de ácidos nucleicos (Tenover et al., 1997).

La tipificación puede proporcionar información sobre la distribución de tipos microbianos en poblaciones humanas y animales, lo cual puede ser aplicado en programas de vigilancia a nivel local, regional, nacional o global. De especial interés pueden ser el monitoreo de marcadores asociados con la patogenicidad, inmunogenicidad o resistencia a medicamentos, como se demuestra por ejemplo en la vigilancia del cólera con la emergencia de una nueva cepa epidémica en Asia.

En síntesis, esta aplicación puede incluir análisis periódicos para la detección de grupos de patógenos con tipos similares y de origen común en espacio y tiempo, para mejorar las advertencias anticipadas de brotes potenciales.

Asimismo, puede ayudar en la planeación de servicios de salud e intervenciones preventivas como desarrollo de vacunas y programas de inmunización.

Estas técnicas también pueden ser usadas en estudios clínicos para la delineación de patrones de colonización y para la identificación de fuentes de transmisión de microorganismos infecciosos, lo cual puede contribuir a un entendimiento de la epidemiología y patogénesis ayudando con ello al desarrollo de estrategias de prevención de enfermedades (Struelens y MESGEM, 1996).

La Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) es una técnica que se utiliza comúnmente en los laboratorios de investigación médicos y biológicos para amplificar (crear copias múltiples de) el ADN, sin utilizar un organismo vivo, tal como la E. coli o una levadura. Asimismo, se emplea en una variedad de tareas, tales como la detección de enfermedades hereditarias, la identificación de huellas digitales genéticas, diagnósticoclínico, análisis forense del ADN, detección de patógenos en el hombre, animales, plantas, y alimentos, e investigación en biología molecular (Saunderset al., 2001).

La PCR fue inventada a principios de los 80´s por Kary Mullis, al cual le fue otorgado el premio Nobel en química en octubre de 1993 por este logro, siete años después de haber publicado sus primeras ideas. La idea de Mullis fue la de desarrollar un proceso a través del cual el ADN se pudiera multiplicar artificialmente a través de ciclos repetidos duplicados llevados a cabo por una enzima llamada ADN-Polimerasa.

La ADN-Polimerasa se produce naturalmente en los organismos vivos, donde funciona para duplicar el ADN cuando las células se dividen. Trabaja uniéndose a una sola hebra de ADN y creando una hebra complementaria.

El proceso original de PCR actualmente ha sido mejorado mediante el uso de la ADN-Polimerasa que procede de una bacteria termofilica que vive a temperaturas arriba de 110 °C (en aguas termales). La ADN-Polimerasa o Taq polimerasa tomada de estos organismos es termoestable (estable en las altas temperaturas).

Actualmente la Taq polimerasa se utiliza frecuentemente en la práctica de PCR. Una desventaja de la Taq es que incurre a veces en equivocaciones al copiar el ADN, conduciendo a mutaciones (errores) en la secuencia del ADN (Saunders et al., 2001).

La PCR que ha sido utilizada por varios años para la detección directa de muchos tipos de agentes infecciosos en muestras clínicas, ha sido adaptada para ser usada como una herramienta de tipificación. La ventaja de la PCR es su habilidad para producir literalmente millones de copias de un segmento de ADN particular con alta fidelidad en un tiempo de 3 a 4 horas (Tenover et al., 1997).

El procedimiento requiere una plantilla de ADN que puede estar presente en la muestra en pequeñas cantidades; dos primers oligonucleótidos que flanquean las secuencias de la plantilla de ADN que va a ser amplificado; y una DNA-polimerasa estable al calentamiento.

Un ensayo típico de PCR requiere aproximadamente de 3 horas para completar 30 ciclos, donde cada ciclo consiste de una fase de desnaturalización, en donde la doble hebra de ADN es fundida en hebras únicas; una fase de alineación, en donde los primers se unen a las secuencias blanco en las hebras separadas; y una fase de extensión, en donde la síntesis de ADN procede de los primers a partir de cada hebra de la plantilla de ADN, generando dos nuevas copias de la doble hebra de la plantilla original. Después de cada 30 ciclos , una sola copia inicial de la plantilla de ADN teóricamente puede ser amplificado a 1 billón de copias (Tenover et al., 1997; Saunders et al., 2003).

5.1.1. Southern

Southern blot, hibridación Southern o, simplemente, Southern es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, después, una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda.¹ Su nombre procede del apellido de su inventor, un biólogo inglés llamado Edwin Southern.

Se muestra la dotación genética (azul) de un individuo homocigoto (A) y uno heterocigoto (B) para un marcador; tras hibridarse con una sonda específica (rosa) se observa el resultado del Southern a la derecha.

Pasos de Southern blot

1. Extracción del ADN

Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas,habitualmente de la sangre.

2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción

El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción,que es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.

3. Electroforesis en gel de agarosa

Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicaión de la muestra.

4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")

Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon,realizando así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot,conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel al secante,el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de la electroforesis.

5. Hibridación con sonda radioactiva

Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración desales que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso de sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.

6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía

Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica,la membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película derayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como autorradiografía.

5.1.2. Northern

Northern blot es una técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un péptidodado en una extracción de ARN total). Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos en base a su tamaño. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la cual se efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o químicamente.¹

El nombre de la técnica deriva de la propia de la detección de ácido desoxirribonucleico (ADN), denominada Southern blot en honor a su descubridor; de este modo, al desarrollarse la técnica equivalente para ARN se empleó el punto cardinal opuesto («northern», septentrional en inglés, frente al meridional «southern»). El northern blot fue desarrollado en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de Stanford.

Procedimiento

El procedimiento general comienza con la extracción del RNA total de una muestra de tejido homogenizado. El mRNA se puede aislar a través del uso de cromatografía para mantener solamente los ARN con colas de poli-A. Las muestras de ARN son entonces separadas por electroforesis en gel. Dada la fragilidad de los geles y la incapacidad de las sondas para penetrar en la matriz, las muestras de RNA, separadas por tamaño tras la electroforesis, serán tranferidas a una membrana de Nailon por medio de capilaridad o un sistema de transferencia al vacío.

Los sistemas de capilaridad iónica se utilizan pra transferir el ARN desde un gel de electroforesis a una membrana de Northern blot.

Una membrana de Nylon cargada positivamente es el soporte mas efectivo para usar en el northern blot ya que los ácidos nucleicos, que están cargados negativamente, tienen una alta afinidad por estas membranas. El buffer de transferencia usado para el ensayo suele contener formamida, dado que ésta consigue disminuir la temperatura de hibridación de la sonda, lo cual previene la degradación del ARN por las altas temperaturas. Una vez que el ARN ha sido transferido a la membrana, este es inmovilizado a través de enlaces covalentes formados con la membrana, lo cual se consigue por medio de luz ultravioleta o calor. Después del marcaje de la sonda, ésta se hibrida con el RNA en la membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar la eficiencia y especificidad de la hibridación están determinadas por las condiciones iónicas, de viscosidad, la presencia de dobles hebras de RNA, bases desemparejadas y composición de las mismas. Finalmente, la membrana debe de lavarse para asegurar que la sonda se ha unido de forma específica y para evitar ruido de fondo en las señales emitidas por la misma. Estas señales serán detectadas porRayos X y pueden ser cuantificadas mediante técnicas de densitometría. Para crear controles y poder asegurarnos de que no se están mostrando genes que no nos interesen se puede realizar posteriormente la determinación por microarrays o RT-PCR.

Geles

El RNA puede correr en un gel de agarosa para mostrar las subunidades ribosomales 28s (banda superior) y 16s (banda inferior).

Las muestras de RNA son normalmente separadas en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizante del RNA para obtener su estructura secundaria. Los geles pueden ser teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta para observar el RNA. Los geles de poliacrilamida con urea también pueden utilizarse, aunque esto suele limitarse a fragmentos de RNA o miRNA, ya que crean un tamaño de poro mas estrecho en su matriz, por lo que el RNA que suele utilizarse no podría desplazarse por el gel. Suele utilizarse además un patrón de RNA con muestras de tamaño conocido para poder extrapolar el tamaño de las muestras en estudio.

Sondas

Las sondas del northern blot están compuestas por ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a todo o parte del RNA que nos interesa. Pueden ser de DNA, RNA o oligonucleótidos, con un mínimo de 25 bases complementarias para nuestra secuencia diana. Las sondas de RNA oribosondas que se transcriben in vitro ayudan a prevenir el ruido de fondo. Normalmente, el DNA complementario se sintetiza con cebadores para la secuencia RNA de interés para actuar como sonda en el Northern blot. Las sondas requieren ser marcadas bien con isótopos radiactivos (³²P) o conquimioluminiscencia, ya sea con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano, las cuáles, tras la adición de su sustrato específico producen una emisión de luz detectable. El marcaje por quimioluminiscencia puede hacerse de dos formas: Por un lado, la sonda puede estar unida a la enzima o bien unida a un ligando (p.ej, biotina) para la cual hay un anticuerpo (avidina o estreptavidina en este caso) está unido a la enzima que revelará el marcaje. Los Rayos X pueden detectar tanto las señales radioactivas como las quimioluminiscentes, siendo preferida por muchos investigadores la segunda, dada su mayor rapidez, sensibilidad y reducción de los riesgos para la salud que conlleva trabajar con compuestos radioactivos.

Aplicaciones

El northern Blot permite observar un patrón particular de expresión genética entre tejidos, órganos, estadios del desarrollo, niveles de estrés ambiental, infecciones causadas por patógenos y durante el curso del tratamiento de las mismas. Esta técnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes supresores tumorales en células cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.

5.1.3. Marcadores moleculares

El concepto de marcador surge con los trabajos de Mendel:

Utilizó los colores de las flores (y otros caracteres morfológicos) como marcadores que le permitieron estudiar los patrones de la herencia.

• Permiten establecer diferencias (polimorfismos) entre dos individuos diferentes (genotipos) pertenecientes a la misma especie (o a especies emparentadas).

• Su herencia suele responder a las leyes de Mendel.

• Los primeros marcadores utilizados fueron los de tipo morfológico (fenotípicos), por ejemplo, color de la flor.

• Permiten la confección de mapas genéticos o de ligamiento.

• Son puntos de referencia ubicados en los cromosomas.

-       Marcadores Genotípicos o moleculares: Los polimorfismos de genes u otras secuencias no codificantes se detectan a nivel del ADN

- Restricción con endonucleasas + hibridación Molecular (ejemplo, RFLP)

- Amplificación por PCR (ejemplo, RAPD y microsatélites)

- Restricción con endonucleasas + PCR: (ejemplo, AFLP)

- Conformación del ADN (ejemplo, SSCP)

- Secuenciación directa

- Base molecular: mutaciones puntuales o estructurales (inserciones, deleciones, variaciones en el número de motivos repetidos en tándem)

5.1.3.1. AFLP

Una de las técnicas nuevas y más promisorias es el AFLP desarrollado por Keygene BV, Wageningen, de Nueva Zelanda. Este método combina una aplicabilidad universal con alto poder de discriminación y reproducibilidad. Un gran número de reportes describen el uso de esta técnica para plantas y mapeo genético animal, diagnósticos clínicos, estudios filogenéticos, y tipificación de bacterias (Savelkoul et al., 1999).

Está basada en la detección de fragmentos de restricción genomica por amplificación con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y puede ser utilizada para ADNs de cualquier origen o complejidad. La técnica comprende tres pasos: 1) la restricción del ADN y la ligazón de adaptadores oligonucleótidos, 2) la amplificación selectiva de juegos de fragmentos de restricción, y 3) análisis del gel de los fragmentos amplificados (Vos et al., 1995; Savelkoul et al., 1999; Struelens, 2001).

El ADN es cortado con enzimas de restricción, y los adaptadores de la doble hebra están ligados al final de los fragmentos del ADN para generar la plantilla de ADN para amplificación. La secuencia de los adaptadores y el sitio de restricción adyacente sirve como sitios de unión de los primer para la subsecuente amplificación de los fragmentos de restricción (Vos et al., 1995).

Para el análisis del AFLP solamente se necesita una pequeña cantidad de ADN genomico purificado; este es digerido como ya se menciono con dos enzimas de restricción, una con una frecuencia media de corte (como la EcoRI) y una segunda con una alta frecuencia de corte (como la MseI o TaqI) (Savelkoul et al., 1999). La infrecuente restricción de los sitios de amplificación, o IRS-PCR, es otra variación de esta propuesta que esta basada en la amplificación selectiva de secuencias de ADN con sitios de restricción infrecuentes a los lados.

Tiene un alto poder discriminatorio que se ajusta fácilmente y un muy buen nivel del patrón de reproducibilidad para un amplio rango de bacterias patógenas tanto Gram positivas como negativas (Struelens, 2001).

5.1.3.2. RAPD

- Consiste en la amplificación mediante PCR de ADN anónimo, utilizando para ello un único iniciador de secuencia arbitraria.

Los oligonucleótidos iniciadores (primers) se diseñan sin tener en cuenta información de la secuencia genómica de la especie a analizar.

- Normalmente se usa un sólo iniciador, de 10 nucleótidos de longitud (más corto que el de una PCR común) y con un alto contenido en G+C.

5.1.3.3. Microsatélites

SSR (Simple Sequence Repeat) o STR (Short Tandem Repeat) por sus siglas en inglés, denominados microsatélites en castellano, son secuencias de ADN en las que un fragmento (cuyo tamaño va desde dos hasta seis pares de bases) se repite de manera consecutiva. La variación en el número de repeticiones crea diferentes alelos.

Generalmente se encuentran en zonas no codificantes del DNA. Son neutros, co-dominantes y poseen una alta tasa de mutación, lo que los hace muy polimórficos. A pesar de esto, la variabilidad que presentan útil para su uso como marcadores moleculares, es respecto al número de repeticiones, no de la secuencia repetida. Son utilizados como marcadores moleculares en una gran variedad de aplicaciones en el campo de la genética como parentescos y estudios de poblaciones

5.1.3.4. Secuencias mitocondriales

Los polimorfismos del ADN mitocondrial (mtADN) se han utilizado ampliamente en análisis filogeneticos y de diversidad genetica. El mtADN haploide, contenido por las mitocondrias en el citoplasma celular, presenta un modo materno de transmision (los individuos heredan el mtADN de sus madres y no de los sementales), asi como una alta tasa de mutacion; no se recombina. Dichas caracteristicas permiten a los biologos reconstruir relaciones evolutivas dentro de una especie y entre distintas especies valorando las pautas de mutacion del mtADN. Los marcadores de mtADN pueden tambien permitir la rapida detección de hibridacion entre especies o subespecies deganado (p. ej., Nijman et al., 2003).

5.1.3.5 Secuencias ribosomales

El ADN ribosómico (ADNr) es una secuencia de ADN contenida en los cromosomas del nucléolo que codifica ARNribosómico. Estas secuencias regulan la transcripción e iniciación de la amplificación y contienen segmentos espaciadores transcribibles y no transcribibles. Las unidades de transcripción del ARN ribosómico se agrupan en tándem. Estas regiones de ADNr se denominan también regiones de organización del nucleolo. En el genoma humano existen cinco cromosomas con ADN ribosómico: los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22.

El nivel bajo de polimorfismo en la unidad de transcripción de ADNr permite la caracterización de cada especie usando sólo unos pocos ejemplares y hace que este ADN sea útil para la comparación interespecífica. Además, las repeticiones de las diferentes regiones de codificación del ADNr muestran distintas tasas de evolución. Como resultado de ello, este ADN puede proporcionar información sobre casi cualquier nivel sistemático.

5.31.3.6 Otros

En Genética molecular, el número variable de repeticiones en tándem (del inglés Variable Number of Tandem Repeats y más conocidas por el acrónimo VNTR) o minisatélites, son repeticiones de secuencias de 9 a 100 pares de bases que se utilizan como marcador molecular. El número de repeticiones es variable pero en general es menor a 1000.

La detección de los VNTR se puede realizar por hibridación del ADN o por técnicas de PCR. En el primer caso, el ADN genómico es digerido con enzimas de restricción que reconocen sitios adyacentes a la región repetida. Los fragmentos se separan por electroforesis, se inmovilizan en una membrana y se detectan mediante sondas al igual que los marcadores RFLPs. La longitud de los fragmentos de restricción producidos en diferentes individuos varía de acuerdo al número de repeticiones del minisatélite. La diferencia básica entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada. En la técnica de VNTR las sondas están constituidas por secuencias homólogas a las secuencias repetidas de los minisatélites, por lo tanto todos los loci hipervariables del genoma son detectados simultáneamente, mientras que en los RFLP, las sondas son homólogas a secuencias únicas del genoma, por lo que se detectan uno o pocos loci cada vez. De esta manera, en el autorradiograma no se obtiene un patrón simple de bandas como en el caso de los RFLP, sino un perfil complejo de bandas múltiples.

Los minisatélites también pueden ser detectados mediante la amplificación por PCR de los segmentos del genoma que contienen diferente número de repeticiones, utilizando para ello iniciadores o "primers" que flanqueen los VNTR. Luego de la amplificación del ADN, los fragmentos se visualizan mediante electroforesis y tinción con bromuro de etidio o técnicas análogas. Esta opción se ha vuelto más frecuente con el aumento de información de secuencias en bases de datos que permiten el diseño de iniciadores flanqueantes de minisatélites.

Los Polimorfismos para la amplificación de regiones blanco, más conocidos por su acrónimo inglés TRAP ("Target Region Amplification Polymorphism"), son un tipo de marcador molecular que está basado en la amplificación del ADN genómico mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

El ensayo TRAP utiliza dos cebadores de 18 nucleótidos de longitud para generar los marcadores. Uno de los cebadores, denominado «cebador fijo», se diseña sobre una secuencia de ADNblanco o diana. El otro cebador, denominado «cebador arbitrario», es una secuencia arbitraria de ADN con un núcleo rico en AT o GC que se unen prefencialmente a exones o intrones, respectivamente. La amplificación por PCR se realiza a través de cinco ciclos con una temperatura de hibridación de 35°C, seguidos por 35 ciclos con una temperatura de hibridación de 50°C. Para diferentes especies de plantas, cada reacción de PCR puede generar hasta 50 fragmentos fácilmente observables con un tamaño que va desde 50 hasta 900 pares de bases.