TÉCNICAS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR BIOTECNOLÓGICO
Objetivo educacional
Conocer y describir la importancia y los alcances de
la ingeniería genética así como sus principales métodos.
5.1. Técnicas basadas en PCR y/o electroforesis
Las técnicas moleculares actuales han sido desarrolladas, en solo
pocos años de investigación académica
básica en muchos campos de la ciencia, de tal
manera que en los últimos años, seis de éstas técnicas han surgido
como los métodos para el análisis y tipificación de los aislamientos
bacterianos.
Ellas son la huella dactilar de plasmidos o PF, el
análisis de endonucleasas de restricción de ADN de plasmidos o REA; el análisis de
endonucleasas de restricción de ADN cromosómico utilizando enzimas de corte y electroforesis convencional; el
Polimorfismo de largos fragmentos de restricción o RFLP utilizando análisis de pruebas de ADN; La electroforesis en gel de
campos pulsantes o PFGE; y el AP-PCR y otras técnicas relacionadas con la
tipificación basada en la amplificación de ácidos nucleicos (Tenover et al., 1997).
La tipificación puede proporcionar información sobre
la distribución de
tipos microbianos en poblaciones humanas y animales, lo cual puede ser aplicado en programas de
vigilancia a nivel local, regional, nacional o global. De especial interés pueden ser el monitoreo de marcadores
asociados con la patogenicidad, inmunogenicidad o resistencia a
medicamentos, como se demuestra por ejemplo en la vigilancia del cólera con la emergencia de una nueva cepa
epidémica en Asia.
En síntesis, esta aplicación puede incluir análisis periódicos
para la detección de grupos de patógenos con tipos similares y de origen
común en espacio y tiempo, para mejorar las advertencias anticipadas de
brotes potenciales.
Asimismo, puede ayudar en la planeación de servicios de salud e intervenciones preventivas como desarrollo de vacunas y programas de inmunización.
Estas técnicas también pueden ser usadas en
estudios clínicos para la delineación de patrones de colonización y para la
identificación de fuentes de transmisión de microorganismos
infecciosos, lo cual puede contribuir a un entendimiento de la epidemiología y
patogénesis ayudando con ello al desarrollo de estrategias de
prevención de enfermedades (Struelens y MESGEM, 1996).
La Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR por sus
siglas en inglés) es una técnica que se utiliza comúnmente en los laboratorios
de investigación médicos y biológicos para amplificar (crear copias múltiples
de) el ADN, sin utilizar un organismo vivo, tal como la E. coli o
una levadura. Asimismo, se emplea en una variedad de tareas, tales como la
detección de enfermedades hereditarias, la identificación de huellas digitales
genéticas, diagnósticoclínico,
análisis forense del ADN, detección de patógenos en el hombre, animales,
plantas, y alimentos, e
investigación en biología molecular (Saunderset al., 2001).
La PCR fue inventada a principios de los
80´s por Kary Mullis, al cual le fue otorgado el premio Nobel en química en octubre de 1993 por este logro, siete años después de haber
publicado sus primeras ideas. La idea de Mullis fue la de desarrollar un proceso a través del cual el ADN se pudiera
multiplicar artificialmente a través de ciclos repetidos duplicados llevados a
cabo por una enzima llamada ADN-Polimerasa.
La ADN-Polimerasa se produce naturalmente en los
organismos vivos, donde funciona para duplicar el ADN cuando las células se
dividen. Trabaja uniéndose a una sola hebra de ADN y creando una hebra
complementaria.
El proceso original de PCR actualmente ha sido
mejorado mediante el uso de la ADN-Polimerasa que procede de una bacteria
termofilica que vive a temperaturas arriba de 110 °C (en aguas termales). La
ADN-Polimerasa o Taq polimerasa tomada de estos organismos es
termoestable (estable en las altas temperaturas).
Actualmente la Taq polimerasa se
utiliza frecuentemente en la práctica de PCR. Una desventaja de la Taq es
que incurre a veces en equivocaciones al copiar el ADN, conduciendo a
mutaciones (errores) en la secuencia del ADN (Saunders et al.,
2001).
La PCR que ha sido utilizada por varios años para
la detección directa de muchos tipos de agentes infecciosos en muestras
clínicas, ha sido adaptada para ser usada como una herramienta de tipificación.
La ventaja de la PCR es su habilidad para producir literalmente millones de
copias de un segmento de ADN particular con alta fidelidad en un tiempo de 3 a 4
horas (Tenover et al., 1997).
El procedimiento requiere una plantilla de ADN que
puede estar presente en la muestra en pequeñas cantidades; dos primers
oligonucleótidos que flanquean las secuencias de la plantilla de ADN que va a
ser amplificado; y una DNA-polimerasa estable al calentamiento.
Un ensayo típico de PCR requiere aproximadamente de 3
horas para completar 30 ciclos, donde cada ciclo consiste de una fase de
desnaturalización, en donde la doble hebra de ADN es fundida en hebras únicas;
una fase de alineación, en donde los primers se unen a las secuencias blanco en
las hebras separadas; y una fase de extensión, en donde la síntesis de ADN
procede de los primers a partir de cada hebra de la plantilla de ADN, generando
dos nuevas copias de la doble hebra de la plantilla original. Después de cada
30 ciclos , una sola copia inicial de la plantilla de ADN teóricamente puede
ser amplificado a 1 billón de copias (Tenover et al., 1997;
Saunders et al., 2003).
5.1.1. Southern
Southern blot, hibridación Southern o, simplemente, Southern es un método de biología
molecular que permite detectar la
presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para
ello, emplea la técnica de electroforesis
en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de
acuerdo a su longitud y, después, una transferencia a una membrana en la cual
se efectúa la hibridación de
la sonda.1 Su nombre procede del apellido de su inventor, un biólogo inglés llamado Edwin Southern.
Se
muestra la dotación genética (azul) de un individuo homocigoto (A) y uno heterocigoto (B) para un marcador; tras
hibridarse con una sonda específica (rosa) se observa el resultado del Southern
a la derecha.
Pasos de
Southern blot
1. Extracción del ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las
posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen,
tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN
extraído de las pruebas del delito ("indicios" o
"vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras de referencia,
obtenidas de personas conocidas,habitualmente de la sangre.
2. Digestión del ADN con una
endonucleasa de restricción
El ADN extraído de la muestra se trata con una
endonucleasa de restricción,que es una enzima que corta el ADN bicatenario en
donde tenga una secuencia característica. La enzima que se usa más
frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la
secuencia 5'-GGCC-3'.
3. Electroforesis en gel de
agarosa
Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN
resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de
agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga
negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN,
su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las
moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las
de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los
fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más
pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de
aplicaión de la muestra.
4. Preparación de un ensayo de
Southern ("Southern blot")
Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se
desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con
una disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario
resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon,realizando
así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés
blot,conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de
desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo
de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante
a un papel con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel al
secante,el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva
la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como
resultado de la electroforesis.
5. Hibridación con sonda
radioactiva
Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o
ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el
ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La
formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de
bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en
el"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un
isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten
un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de
Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una
sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y
concentración desales que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se
lava el exceso de sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede
en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.
6. Detección de los RFLPs
mediante autorradiografía
Las
posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo
de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica,la membrana
de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película derayos X dentro de
una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay
desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el
registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como
autorradiografía.
5.1.2. Northern
Northern blot es una técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla
compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un péptidodado
en una extracción de ARN total). Para ello, se toma la mezcla de ARN y se
somete a una electroforesis en
gel a fin
de separar los fragmentos en base a su tamaño. Tras esto, se transfiere el
contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la cual
se efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o químicamente.1
El
nombre de la técnica deriva de la propia de la detección de ácido
desoxirribonucleico (ADN),
denominada Southern blot en honor a su descubridor; de este modo, al
desarrollarse la técnica equivalente para ARN se empleó el punto cardinal
opuesto («northern», septentrional en inglés, frente al meridional «southern»).
El northern blot fue desarrollado en 1977 por James Alwine, David Kemp y George
Stark en la Universidad de
Stanford.
Procedimiento
El
procedimiento general comienza con la extracción del RNA total de una muestra de tejido homogenizado. El
mRNA se puede aislar a través del uso de cromatografía para mantener solamente los ARN con colas de poli-A. Las
muestras de ARN son entonces separadas por electroforesis en
gel. Dada la fragilidad de los geles y la incapacidad
de las sondas para penetrar en la matriz, las muestras de RNA, separadas por
tamaño tras la electroforesis, serán tranferidas a una membrana de Nailon por
medio de capilaridad o un sistema de transferencia al vacío.
Los sistemas de capilaridad iónica se utilizan pra
transferir el ARN desde un gel de electroforesis a una membrana de Northern
blot.
Una
membrana de Nylon cargada positivamente es el soporte mas efectivo
para usar en el northern blot ya que los ácidos nucleicos, que
están cargados negativamente, tienen una alta afinidad por estas membranas. El
buffer de transferencia usado para el ensayo suele contener formamida, dado que ésta consigue disminuir la temperatura de
hibridación de la sonda, lo cual previene la degradación del ARN por las altas
temperaturas. Una vez que el ARN ha sido transferido a la membrana, este es
inmovilizado a través de enlaces covalentes formados con la membrana, lo cual se consigue por
medio de luz ultravioleta o calor.
Después del marcaje de la sonda, ésta se hibrida con el RNA en la membrana. Las
condiciones experimentales que pueden afectar la eficiencia y especificidad de
la hibridación están determinadas por las condiciones iónicas, de viscosidad,
la presencia de dobles hebras de RNA, bases desemparejadas y composición de las mismas.
Finalmente, la membrana debe de lavarse para asegurar que la sonda se ha unido
de forma específica y para evitar ruido de fondo en las señales emitidas por la
misma. Estas señales serán detectadas porRayos X y pueden ser cuantificadas mediante técnicas de densitometría.
Para crear controles y poder asegurarnos de que no se están mostrando genes que
no nos interesen se puede realizar posteriormente la determinación por microarrays o RT-PCR.
Geles
El RNA puede correr en un gel de agarosa para
mostrar las subunidades ribosomales 28s (banda superior) y 16s (banda inferior).
Las
muestras de RNA son normalmente separadas en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizante del RNA para obtener
su estructura secundaria. Los geles pueden ser teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta para observar el RNA. Los geles de poliacrilamida con urea también pueden utilizarse, aunque esto suele
limitarse a fragmentos de RNA o miRNA, ya que crean un
tamaño de poro mas estrecho en su matriz, por lo que el RNA que suele
utilizarse no podría desplazarse por el gel. Suele utilizarse además un patrón
de RNA con muestras de tamaño conocido para poder extrapolar el tamaño de las
muestras en estudio.
Sondas
Las
sondas del northern blot están compuestas por ácidos nucleicos con una
secuencia complementaria a todo o parte del RNA que nos interesa. Pueden ser de
DNA, RNA o oligonucleótidos, con un mínimo de 25 bases complementarias para
nuestra secuencia diana. Las sondas de RNA oribosondas que se transcriben in vitro ayudan a prevenir el ruido de fondo. Normalmente,
el DNA complementario se sintetiza con cebadores para la secuencia RNA de
interés para actuar como sonda en el Northern blot. Las sondas requieren ser
marcadas bien con isótopos radiactivos (32P) o conquimioluminiscencia, ya
sea con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano, las
cuáles, tras la adición de su sustrato específico producen una emisión de luz
detectable. El marcaje por quimioluminiscencia puede hacerse de dos formas: Por
un lado, la sonda puede estar unida a la enzima o bien unida a un ligando
(p.ej, biotina) para la cual hay un anticuerpo (avidina o estreptavidina en este caso) está unido a la enzima que revelará
el marcaje. Los Rayos X pueden detectar tanto las señales radioactivas como las
quimioluminiscentes, siendo preferida por muchos investigadores la segunda,
dada su mayor rapidez, sensibilidad y reducción de los riesgos para la salud
que conlleva trabajar con compuestos radioactivos.
Aplicaciones
El
northern Blot permite observar un patrón particular de expresión genética entre
tejidos, órganos, estadios del desarrollo, niveles de estrés ambiental,
infecciones causadas por patógenos y durante el curso del tratamiento de las
mismas. Esta técnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de
oncogenes y la desregulación de genes supresores
tumorales en células cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.
5.1.3. Marcadores moleculares
El concepto de marcador surge con los trabajos de
Mendel:
Utilizó los colores de las flores (y otros caracteres morfológicos) como
marcadores que le permitieron estudiar los patrones de la herencia.
• Permiten establecer diferencias (polimorfismos)
entre dos individuos diferentes (genotipos) pertenecientes a la misma
especie (o a especies emparentadas).
• Su herencia suele responder a las leyes de
Mendel.
• Los primeros marcadores utilizados fueron los
de tipo morfológico (fenotípicos), por ejemplo, color de la flor.
• Permiten la confección de mapas genéticos o
de ligamiento.
• Son puntos de referencia ubicados en los
cromosomas.
-
Marcadores Genotípicos o moleculares: Los polimorfismos de genes u otras secuencias no
codificantes se detectan a nivel del ADN
- Restricción con endonucleasas + hibridación Molecular (ejemplo, RFLP)
- Amplificación por PCR (ejemplo, RAPD y microsatélites)
- Restricción con endonucleasas + PCR: (ejemplo, AFLP)
- Conformación del ADN (ejemplo, SSCP)
- Secuenciación directa
- Base molecular: mutaciones puntuales o estructurales (inserciones,
deleciones, variaciones en el número de motivos repetidos en tándem)
5.1.3.1. AFLP
Una de las técnicas nuevas y más promisorias es el
AFLP desarrollado por Keygene BV, Wageningen, de Nueva Zelanda. Este método combina una aplicabilidad universal con alto
poder de discriminación y reproducibilidad. Un gran número de reportes
describen el uso de esta técnica para plantas y mapeo genético animal, diagnósticos
clínicos, estudios filogenéticos, y tipificación de bacterias (Savelkoul et
al., 1999).
Está basada en la detección de fragmentos de
restricción genomica por amplificación con reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) y puede ser utilizada para ADNs de cualquier origen o complejidad. La
técnica comprende tres pasos: 1) la restricción del ADN y la ligazón de
adaptadores oligonucleótidos, 2) la amplificación selectiva de juegos de fragmentos de restricción, y 3) análisis
del gel de los fragmentos amplificados (Vos et al., 1995; Savelkoul et
al., 1999; Struelens, 2001).
El ADN es cortado con enzimas de restricción, y los
adaptadores de la doble hebra están ligados al final de los fragmentos del ADN
para generar la plantilla de ADN para amplificación. La secuencia de los
adaptadores y el sitio de restricción adyacente sirve como sitios de unión de
los primer para la subsecuente amplificación de los fragmentos de restricción
(Vos et al., 1995).
Para el análisis del AFLP solamente se necesita una
pequeña cantidad de ADN genomico purificado; este es digerido como ya se
menciono con dos enzimas de restricción, una con una frecuencia media de corte
(como la EcoRI) y una segunda con una alta frecuencia de corte
(como la MseI o TaqI) (Savelkoul et al.,
1999). La infrecuente restricción de los sitios de amplificación, o IRS-PCR, es
otra variación de esta propuesta que esta basada en la amplificación selectiva
de secuencias de ADN con sitios de restricción infrecuentes a los lados.
Tiene un alto poder discriminatorio que se ajusta
fácilmente y un muy buen nivel del patrón de reproducibilidad para un amplio
rango de bacterias patógenas tanto Gram positivas como negativas (Struelens,
2001).
5.1.3.2. RAPD
- Consiste en la amplificación mediante PCR de ADN anónimo, utilizando
para ello un único iniciador de secuencia arbitraria.
Los oligonucleótidos iniciadores (primers) se diseñan sin tener
en cuenta información de la secuencia genómica de la especie a analizar.
- Normalmente se usa un sólo iniciador, de 10 nucleótidos de longitud
(más corto que el de una PCR común) y con un alto contenido en G+C.
5.1.3.3. Microsatélites
SSR (Simple
Sequence Repeat) o STR (Short
Tandem Repeat) por sus siglas en inglés, denominados microsatélites en
castellano, son secuencias de ADN en las que un fragmento (cuyo tamaño
va desde dos hasta seis pares de bases) se repite de manera consecutiva. La
variación en el número de repeticiones crea diferentes alelos.
Generalmente se encuentran en zonas no codificantes
del DNA. Son neutros, co-dominantes y poseen una alta tasa de mutación, lo que los hace muy polimórficos. A
pesar de esto, la variabilidad que presentan útil para su uso como marcadores
moleculares, es respecto al número de repeticiones, no de la secuencia
repetida. Son utilizados como marcadores moleculares en una gran variedad de aplicaciones
en el campo de la genética como
parentescos y estudios de poblaciones
5.1.3.4. Secuencias mitocondriales
Los
polimorfismos del ADN mitocondrial (mtADN) se han utilizado ampliamente en análisis
filogeneticos y de diversidad genetica. El mtADN haploide, contenido por las
mitocondrias en el citoplasma celular, presenta un modo materno de transmision
(los individuos heredan el mtADN de sus madres y no de los sementales), asi
como una alta tasa de mutacion; no se recombina. Dichas caracteristicas
permiten a los biologos reconstruir relaciones evolutivas dentro de una especie
y entre distintas especies valorando las pautas de mutacion del mtADN. Los
marcadores de mtADN pueden tambien permitir la rapida detección de hibridacion
entre especies o subespecies deganado (p. ej., Nijman et al., 2003).
5.1.3.5 Secuencias ribosomales
El ADN ribosómico (ADNr) es una secuencia de ADN contenida en los cromosomas del nucléolo que
codifica ARNribosómico.
Estas secuencias regulan la transcripción e iniciación de la amplificación y
contienen segmentos espaciadores transcribibles y no transcribibles. Las
unidades de transcripción del ARN ribosómico se agrupan en tándem. Estas
regiones de ADNr se denominan también regiones de organización del nucleolo. En
el genoma humano existen cinco cromosomas con ADN ribosómico: los cromosomas
13, 14, 15, 21 y 22.
El nivel bajo de polimorfismo en la unidad de
transcripción de ADNr permite la caracterización de cada especie usando sólo
unos pocos ejemplares y hace que este ADN sea útil para la comparación
interespecífica. Además, las repeticiones de las diferentes regiones de
codificación del ADNr muestran distintas tasas de evolución. Como resultado de
ello, este ADN puede proporcionar información sobre casi cualquier nivel
sistemático.
5.31.3.6 Otros
En Genética molecular, el número variable de repeticiones en tándem (del inglés Variable Number of Tandem Repeats y más conocidas por el acrónimo VNTR) o minisatélites, son repeticiones de
secuencias de 9 a 100 pares de bases que se utilizan como marcador molecular. El
número de repeticiones es variable pero en general es menor a 1000.
La detección de los VNTR se puede realizar por hibridación del ADN o por técnicas de PCR. En
el primer caso, el ADN genómico es
digerido con enzimas de restricción que reconocen sitios adyacentes a la
región repetida. Los fragmentos se separan por electroforesis, se inmovilizan en una membrana
y se detectan mediante sondas al igual que los marcadores RFLPs. La
longitud de los fragmentos de restricción producidos en diferentes individuos
varía de acuerdo al número de repeticiones del minisatélite. La diferencia
básica entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda
utilizada. En la técnica de VNTR las sondas están constituidas por secuencias
homólogas a las secuencias repetidas de los minisatélites, por lo tanto todos
los loci hipervariables del genoma son detectados simultáneamente, mientras que
en los RFLP, las sondas son homólogas a secuencias únicas del genoma,
por lo que se detectan uno o pocos loci cada vez. De esta manera, en el autorradiograma no se obtiene un patrón simple de
bandas como en el caso de los RFLP, sino un perfil complejo de bandas
múltiples.
Los minisatélites también pueden ser detectados
mediante la amplificación por PCR de los segmentos del genoma que
contienen diferente número de repeticiones, utilizando para ello iniciadores o
"primers" que flanqueen los VNTR. Luego de la amplificación del ADN,
los fragmentos se visualizan mediante electroforesis y tinción con bromuro de etidio o técnicas análogas. Esta opción se ha
vuelto más frecuente con el aumento de información de secuencias en bases de
datos que permiten el diseño de iniciadores flanqueantes de minisatélites.
Los Polimorfismos para la amplificación de
regiones blanco, más conocidos por su acrónimo inglés TRAP ("Target
Region Amplification Polymorphism"), son un tipo de marcador molecular que está basado en la amplificación
del ADN genómico mediante la reacción en cadena
de la polimerasa.
El ensayo TRAP utiliza dos cebadores de 18 nucleótidos de
longitud para generar los marcadores. Uno de los cebadores, denominado «cebador
fijo», se diseña sobre una secuencia de ADNblanco
o diana. El otro cebador, denominado «cebador arbitrario», es una secuencia
arbitraria de ADN con un núcleo rico en AT o GC que se unen prefencialmente a exones o intrones,
respectivamente. La amplificación por PCR se realiza a través de cinco ciclos
con una temperatura de hibridación de 35°C, seguidos por 35 ciclos con una
temperatura de hibridación de 50°C. Para diferentes especies de plantas,
cada reacción de PCR puede generar hasta 50 fragmentos fácilmente observables
con un tamaño que va desde 50 hasta 900 pares de bases.
