UNIDAD III

“TÉCNICAS IN VITRO EN EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES”

Objetivo educacional

- Conocer y manejar adecuadamente las técnicas del cultivo de tejidos vegetales

3.1. Generalidades

En los últimos años se ha verificado un incremento relevante en la producción de plantas ornamentales, este hecho posiblemente haya sido una consecuencia del aumento registrado en su valor comercial durante los últimos 20 años. Hoy en día alrededor de 150 especies diferentes de plantas ornamentales son propagadas a escala comercial a través del cultivo de tejidos en laboratorios privados, que proveen a los mayores consumidores del mercado florícola: Holanda, Japón y EEUU entre otros.

El cultivo in vitro de tejidos resulta una herramienta clave para la propagación de plantas a gran escala, debido que permite no solo la producción masiva, sino la conservación de material selecto y la multiplicación de clones de sanidad controlada.

En la actualidad se utilizan principalmente tres estrategias para la multiplicación in vitro:

1) organogénesis

2) embriogénesis somática

3) tecnología de cultivo de células en capa fina (TLC, thin cell layer) para la multiplicación de plantas entre otras aplicaciones.

3.2. Micropropagación

La micropropagación consiste en la propagación de plantas en un ambiente artificial controlado, empleando un medio de cultivo adecuado.

El cultivo es así una herramienta muy útil en los programas de mejoramiento, ya que tiene el potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicación ilimitada. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las células vegetales; esto es la capacidad de regenerar una planta completa cuando están sujetas a los estímulos adecuados. Así, las células somáticas de cualquier tejido podrían formar tallos, raíces o embriones somáticos de acuerdo con la competencia que posea y al estímulo que reciban .

Dependiendo de las características de la planta que se pretenda propagar y del objetivo perseguido, la micropropagación puede realizarse a través de tres vías de regeneración: brotación de yemas adventicias preexistentes, producción de yemas de novo y embriogénesis somática.

3.2.1 Descripción e importancia

La micropropagación presenta cuatro etapas principales: 1) establecimiento del cultivo, 2) desarrollo y multiplicación de vástagos o embriones, 3) enraizamiento y 4) aclimatación de las plántulas. Generalmente, las etapas de enraizamiento y aclimatación pueden combinarse en condiciones ex vitro. En el caso de la embriogénesis somática, el enraizamiento es reemplazado por una etapa de maduración y germinación de los embriones para la diferenciación de los ápices caulinar y radicular.

En algunos casos tiene importancia considerar una etapa previa (Etapa 0) que es la etapa de preparación de los explantes para el establecimiento.

La correcta elección y preparación del explante incide directamente sobre la calidad del mismo y su respuesta frente a los dos principales problemas que afectan al establecimiento del cultivo, que son la contaminación con microorganismos y la oxidación del explante.

Una vez colectado en el campo este material se prepara, esteriliza, luego se siembra en un medio de cultivo enriquecido, allí se multiplica, se cultiva en un medio de enraizamiento, luego se lleva a condiciones de invernadero, se siembra en bolsa con tierra para aclimatación y producción de nuevas raíces, y por último las plantas se siembran en el campo.

3.2.2 Tejidos empleados

Los factores que influyen sobre la calidad del explante son: el tipo de órgano que sirve como explante, la edad ontogénica y fisiológica del mismo, la estación en la cual se colecta el material vegetal, el tamaño y el estado sanitario general de la planta donante.

La planta donante debe elegirse en base a una selección masal positiva para las características agronómicas deseables. Una vez seleccionados los individuos, es preciso definir el tipo de explante a establecer en condiciones in vitro. En general, los órganos jóvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos.

El empleo de explantes que se encuentran expuestos a bajos niveles de patógenos puede resolver el problema de la contaminación por hongos y bacterias durante el establecimiento del cultivo in vitro. Se recomienda colectar explantes primarios a campo durante la estación primaveral y estival, cuando existe una brotación activa de las yemas, ya que el empleo de yemas en estado de dormición ocasiona serios problemas de contaminación.

A fin de lograr explantes de óptima calidad es conveniente hacer crecer las plantas donantes por un tiempo mínimo en condiciones de invernáculo. De esta forma es posible incidir directamente sobre el estado sanitario y la calidad de los explantos mediante el control de la intensidad lumínica, temperatura y reguladores de crecimiento.

Para especies ornamentales tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas donantes en condiciones de alta temperatura (25ºC) y baja humedad relativa (75%) a fin de reducir la proliferación de patógenos.

Los procesos morfogénicos de floración, dormición y bulbificación son controlados por el fotoperíodo y la temperatura. Controlando estos factores también es posible obtener plantas donantes y explantos más homogéneos durante todo el año. Pueden aplicarse además pretratamientos con reguladores de crecimiento a las plantas donantes, así como también a los explantos mismos. En especies leñosas suele utilizarse como pretratamiento la inmersión de los explantes primarios en soluciones con citocininas a fin de inducir la brotación de yemas.

3.2.3 Rutas: organogénesis y Embriogénesis somática

La embriogénesis somática y la organogénesis son dos procesos morfogénicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales.

La embriogénesis somática es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar a un embrión cigótico sin que medie la fertilización de las gametas, mientras que por organogénesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores. Estos órganos son inducidos a partir de una célula o de un grupo de células que, según las condiciones de cultivo, tienen la propiedad de mantenerse en activa división.

Esta totipotencialidad celular fue enunciada por Haberlandt en 1902, quien propuso la teoría de que todas las células vegetales tienen la capacidad de regenerar plantas completas. Haberlandt no llegó a demostrar su hipótesis debido a que no pudo lograr la división celular.

La organogénesis puede darse por inducción de yemas axilares o adventicias. La inducción de yemas axilares comprende la multiplicación de yemas preformadas, usualmente sin formación de callo. La inducción de yemas adventicias comprende la inducción de tejido meristemático localizado mediante un tratamiento con reguladores de crecimiento, conduciendo a la diferenciación del primordio y desarrollo del vástago, esto último generalmente en ausencia del regulador de crecimiento que indujo la organogénesis.

La principal desventaja del primer método es que el número de yemas axilares por explanto limita la cantidad de vástagos. Esto se ve compensado, sin embargo, por un aumento en la tasa de multiplicación con los sucesivos subcultivos. La formación de yemas adventicias ofrece mayor potencial para la producción de vástagos, ya que ocurre en sitios distintos al de los meristemas.

La embriogénesis somática es una vía más conveniente porque permite saltar las etapas de formación de yemas y enraizamiento, regenerando plantas en una forma mucho más rápida y eficiente. A su vez, la disponibilidad de protocolos para la obtención de embriones somáticos es clave para la automatización de la micropropagación y la consecuente reducción de costos para su implementación a escala comercial.

Como se menciono anteriormente la Organogénesis: Se refiere a la vía de morfogénesis que sigue el explante para llegar a convertirse en plántula. Dependiendo del tipo de explante puede seguir las siguientes rutas:

• Organogénesis directa: Consiste en la generación de plantas sin raíces directamente del explante, esta ruta generalmente se sigue cuando se utilizan meristemos vegetativos terminales o laterales.

• Embriogénesis directa: Previa a la generación de la plántula se requiere la formación de un embrión de origen sexual que llegará a ser una planta completa, es el caso de explantes provenientes de granos de polen que forman un embrión haploide, o embrionesdiploides de semillas o tejido ovular.

• Organogénesis indirecta: El explante genera la formación de una masa indiferenciada de células llamada callo, a partir de éste se forman partes vegetativas diferenciadas como brotes o raíces, de las cuales se obtiene la plántula según sea la especie y las hormonas utilizadas. Este es el caso principalmente del cultivo de protoplastos.

• Embriogénesis indirecta: El explante genera la formación de una masa indiferenciada de células llamada callo a partir de éste se forman embriones somáticos, del cual se obtiene la plántula según sea la especie y las hormonas utilizadas. Este es el caso de secciones de tallo, hoja o raíz y protoplastos.

3.2.4 Aplicación agronómica 

La técnica micropropagación in vitro de plantas está siendo empleado eficientemente en muchos cultivos hortícolas ornamentales y recientemente en especies leñosas.

Cuando ya se tiene establecido el protocolo de laboratorio, ésta presenta con relación a los métodos convencionales anteriormente expuestos importantes ventajas como:

Incremento acelerado del número de plantas por cada genotipo, reducción del tiempo de multiplicación, producción permanente de material (no hay estacionalidad), posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una superfi cie reducida (en tiempos y costos económicamente viables), mayor control sobre la sanidad del material propagado, facilidad para el transporte del material, posibilidades de multiplicar con rapidez una variedad o ecotipo del cual se posea pocos individuos.

Los costos iniciales cuando se emplean estas técnicas son altos debido a la inversión en equipos, los precios de los reactivos y la utilización de personal calificado. Sin embargo, los incrementos en la eficiencia por el gran número de plantas sanas que se pueden obtener a partir de un solo ápice en un corto tiempo en una pequeña área, hacen que esta técnica esté siendo ampliamente empleada en plantas que con otras condiciones de propagación presentan menos ventajas.

3.3 Plantas libres de patógenos

Las enfermedades causadas por virus y otros patógenos transmisibles por injerto (viroides, fitoplasmas, bacterias) causan graves daños económicos y su control es esencial para obtener una adecuada rentabilidad de los cultivos. Para realizar este control es imprescindible iniciar las plantaciones con material sano, además de adoptar medidas complementarias para paliar los daños ocasionados por los patógenos transmisibles por vectores.

En las especies propagadas por semilla la obtención de plantas sanas es muy sencilla, ya que la mayoría de los patógenos no se transmiten por semillas y los que lo hacen es con incidencia relativamente baja. En cambio la obtención de plantas sanas de especies que se propagan vegetativamente es mucho más complicada. Estas especies son normalmente muy heterocigóticas, por lo que la propagación por semillas no mantiene las características específicas de la variedad o clon Además, los virus y patógenos similares se transmiten con alta eficiencia en el proceso de propagación vegetativa, por lo que en numerosas ocasiones todas las plantas disponibles de un clon están infectadas. Por ello es necesario utilizar técnicas específicas para obtener plantas sanas a partir de plantas enfermas.

3.3.1 Descripción e importancia

Actualmente las técnicas utilizadas para obtener plantas libres de patógenos  se basan en que los ápices caulinares (meristemo apical más 1-3 primordios foliares con tamaño comprendido entre 0’1 y 0'5 mm) están normalmente libres de patógenos aunque el resto de los tejidos de la planta estén infectados y en que se pueden regenerar plantas enteras a partir de estos pequeños ápices.

3.3.2 Cultivo de meristemos apicales

Esta técnica consiste en aislar el meristemo y sembrarlo en un medio de cultivo adecuado que posibilite el desarrollo de una planta completa.

El término cultivo de meristemo, por lo general, no es correctamente empleado, ya que en la mayoría de los casos se siembra el domo meristemático acompañado por uno o dos primordios foliares. El domo es una estructura de menos de 0,1 mm de diámetro muy difícil de extraer con éxito en forma aislada, y de la cual resulta con frecuencia complicado obtener plantas completas. Para ello es necesario un medio de cultivo con una concentración de nutrientes muy equilibrada y condiciones ambientales muy estrictas. Por consiguiente los resultados en ese sentido han sido muy pobres. Por esta razón, en la mayoría de los casos, se utiliza el domo acompañado de uno ó más primordios foliares. Tal vez lo más aconsejable sería utilizar el término cultivo de «yema», o «brote», o «tallo». A pesar de ello, en este capítulo utilizaremos la denominación cultivo de meristemo por ser esta la terminología más difundida, aunque no sea estrictamente correcta. En general se considera que las plantas provenientes del cultivo de meristemo son idénticas u homólogas a la planta madre de donde se extrajo el explante. Por el contrario, las plantas derivadas de otros tejidos como callos, nucela, primordios florales o protoplastos, usualmente presentan distintos grados de variabilidad. Esto último no es deseable para la producción de plantas libres de virus, donde el objetivo que se persigue es mejorar la sanidad de la planta pero conservar el resto de sus características agronómicas. Sin embargo, es importante aclarar que han sido señaladas ciertas mutaciones en plantas provenientes de cultivo de meristema, pero con mucha menos frecuencia y menos importantes que las detectadas con otros sistemas de obtención de plantas in vitro.

El meristema apical incluye las células meristemáticas iniciales y sus derivadas inmediatas del ápice de la raíz o del brote. El número de células iniciales es variable y pueden presentarse en una o más filas. Dentro del meristema apical se distinguen dos zonas de tejido: la túnica, que consta de una o más capas periféricas de células, y el cuerpo, masa celular rodeada por la túnica.

3.3.3 Cultivo de ápices meristematicos

Los ápices normalmente utilizados para obtener plantas libres de patógenos están compuestos por el meristemo apical y uno a tres primordios foliares, con un tamaño comprendido entre 0’1 y 0'5 mm desde la superficie de corte hasta el extremo del primordio foliar de mayor tamaño. Con frecuencia en la literatura científica y técnica se comete el error de denominar a la técnica "cultivo de meristemos" in vitro. Sin embargo, son muy pocos los casos en los que se ha conseguido regenerar plantas enteras a partir del domo meristemático, que suele tener unas dimensiones inferiores a 0'06 mm, su aislamiento es muy difícil y su viabilidad muy baja.

3.3.4 Cultivo de embriones

Esta técnica se ha utilizado para los siguientes propósitos: estudiar los requerimientos nutricionales de embriones en desarrollo, rescatar embriones híbridos que se hayan derivado de cruzamientos interespecíficos e intergenéricos, producir monoploides y superar la latencia de las semillas, etc.

El desarrollo de embriones vegetales se caracteriza por dos estados distintos: el estado temprano (heterotrófico) y el estado tardío (autotrófico).

Cultivo de embriones

Ha sido efectivo en el mejoramiento de la cebada.

Otra aplicación del cultivo de embriones es el rescate de material de propagacion en los frutales deciduos cuyas semillas son generalmente de baja viabilidad. También ha servido para obtener híbridos en especies como peras y albaricoques.

Por otro lado, esta técnica ha ayudado al mejoramiento genético de especies arbóreas porque acorta el periodo de siembra-floración y el periodo de de latencia de semillas.

Factores que afectan el cultivo

Medio de cultivo: el medio modificado de Murashige et al. (1962) parece estar mas cerca del medio ideal.

Para embriones aislados de óvulos muy jóvenes se usan algunos medios relativamente complejos; pueden incluir aminoácidos, vitaminas y varios extractos de plantas, además de los componentes orgánicos y minerales del medio. El agua de coco no esterilizada por medio de filtración, ha sido muy benéfica para el cultivo de embriones de ciertas especies de plantas, con la adición de glutamina o CH aumenta su efecto.

Osmolaridad: el endosperma liquido empleado en los medios para embriones muy jóvenes tienen una osmolaridad alta, incrementando la concentración de sacarosa en el medio es posible cultivar embriones muy jóvenes provenientes de varias espacies de plantas.

Reguladores de crecimiento: su efecto en el cultivo de embriones no es muy claro.

Cultivo de embriones para la hibridación

Esta técnica se ha utilizado para rescatar embriones derivados de cruzamientos interespecíficos (algodón, papaya, etc.). También ha sido útil para rescatar híbridos intergenérios y para rescatar embriones abortados en uvas sin semillas.

Factores que afectan el cultivo

Placenta: la velocidad del desarrollo embrionario en los cultivos de óvulos se puede aumentar, algunas veces, por medio del cultivo de óvulos con la placenta todavía adherida a ellos.

Osmolaridad: la concentración osmótica del medio afecta el desarrollo de los embriones separados y también el cultivo de óvulos.

Reguladores de crecimiento: el agua de coco esterilizada por filtración y la KIN usadas conjuntamente, estimulan el crecimiento y el desarrollo de embriones en los cultivos de óvulos.

3.3.6 Factores que ayudan a incrementar la posibilidad de obtener plantas libres de patógenos

Varios factores pueden afectar el buen desarrollo in vitro de una planta a partir de un meristemo: el medio de cultivo empleado, el estado fisiológico del explante, la concentración de hormonas endógenas del explante, las contaminaciones internas o externas producidas durante el desarrollo del cultivo, el tamaño y localización del explanto, etc.

El tipo de patógeno es muy importante. Las bacterias endógenas, fitoplasmas y micoplasmas son muy fáciles de eliminar, debido a que su gran tamaño relativo hace difícil que puedan infectar las células de los ápices.

La eliminación de virus y viroides es más difícil, pero existe una gran variabilidad en los resultados. Algunos son muy fáciles de eliminar y prácticamente el 100% de las plantas obtenidas están sanas, pero otros son muy difíciles y sólo se eliminan de un pequeño porcentaje de las plantas obtenidas. Probablemente estas diferencias están relacionadas con la mayor o menor facilidad de estos patógenos de moverse de célula a célula en los tejidos del huésped. Este factor es también probablemente responsable de que un mismo patógeno sea más fácil de eliminar en unos clones que en otros de una misma especie.

Las condiciones de cultivo de las plantas infectadas fuente de ápices también influencian la eliminación de patógenos. Las condiciones óptimas de cultivo que favorezcan la formación de brotes vigorosos favorecen la eliminación de patógenos. La temperatura de cultivo de las plantas es muy importante. El cultivo de las plantas infectadas a temperaturas altas dificulta la replicación y movimiento de los patógenos termosensibles, por lo que se facilita su eliminación. Temperaturas de 30-32∞C durante 2-3 semanas pueden ser suficientes para incrementar de forma muy importante la incidencia de eliminación de algunos patógenos, e incluso tratamientos de termoterapia seguidos de cultivo o microinjerto de ápices se utilizan rutinariamente en algunos programas.

El tamaño del ápice juega un papel importante en la eliminación de patógenos. El aumento de tamaño incrementa el porcentaje de regeneración y de prendimiento, pero reduce la proporción de plantas sanas obtenidas.

3.3.7 Aplicación agronómica

El cultivo de tejidos es la biotecnología moderna que probablemente ha tenido mayor impacto en la agricultura en los últimos años. Una de sus aplicaciones más importantes es la obtención de plantas libres de patógenos. La primera demostración de eliminación de virus mediante cultivo de ápices in vitro la realizó el Dr. Morel en Francia en 1948 que obtuvo plantas de dalia libres de virus a partir de plantas infectadas.

El cultivo de meristemos ha sido utilizado con éxito para distintos objetivos, entre ellos los más frecuentes son la rápida clonación de material deseable (micropropagación), conservación de germoplasma a baja temperatura o criopreservación y para la obtención de plantas libres de patógenos sistémicos

3.4. Técnicas in Vitro aplicadas al fitomejoramiento

Si bien el mejoramiento genético convencional ha tenido un gran impacto en el incremento del rendimiento, la calidad y la resistencia a plagas y enfermedades en cereales y oleaginosas, en las especies forrajeras los progresos han sido significativamente menores, especialmente en lo referido al rendimiento. Esto obedece a varios factores como un proceso más reciente de domesticación, la complejidad de objetivos, problemas reproductivos, de mercado y las menores inversiones realizadas en el área. Las herramientas biotecnológicas desarrolladas en los últimos 20 años ofrecen interesantes alternativas que pueden contribuir a mejorar esta situación.

En los últimos años la biotecnología ha aportado varias metodologías para complementar los programas de mejoramiento, como el cultivo de tejidos, la hibridación somática, la variación somaclonal y la transgénesis. Esta última resulta muy promisoria, especialmente para incrementar la calidad del forraje, persistencia, resistencia a plagas y enfermedades, tolerancia a estreses abióticos y para manipular el crecimiento y desarrollo. Los marcadores moleculares brindan su utilidad para la identificación y selección de caracteres agronómicos complejos. Más recientemente, la genómica permite identificar a gran escala genes de interés para su introducción en los forrajes. Todas estas tecnologías confluyen en el mejoramiento molecular, que permitirá obtener nuevos cultivares para satisfacer las demandas actuales de producción.

3.4.1 Producción de haploides: cultivo de anteras y óvulos

Para referirnos al término haploide es necesario conocer previamente el origen de dicha denominación, y definir algunos conceptos básicos sobre el tema. Si consideramos haploide al individuo que posee un solo juego de cromosomas de la especie, no estaríamos incluyendo en esta clasificación a aquellos individuos derivados de especies poliploides, cuya constitución genética es igual a la de los gametos normales de dicha especie. Por ejemplo, un autopoliploide AAAA (2n = 4x) daría lugar a individuos “haploides” AA (n = 2x), que por tener dos juegos cromosómicos (AA) no podrían ser incluidos en la definición. Por lo tanto, una solución sería denominar como haploides a los individuos originados a partir de especies diploides, que posean un solo juego de cromosomas (n = x), llamando polihaploides a aquellos individuos con una composición cromosómica igual que la gamética normal de la especie, que tengan dos o más juegos cromosómicos (n > x). Otra posibilidad sería considerar el término haploide en un sentido más amplio, comprendiendo en éste a todos los individuos que posean una constitución cromosómica igual a la de los gametos normales de la especie (n = 2n/2). Llamaríamos de esta manera monoploides y polihaploides a los individuos provenientes de plantas diploides (2n= 2x) y poliploides (2n> 2x) respectivamente. De aquí en adelante, a los fines prácticos y en concordancia con la segunda definición, nos referiremos al término haploide indistintamente del nivel de ploidía de la especie en cuestión, como a aquellos individuos que poseen la mitad del número cromosómico normal contenido en las células somáticas de la especie.

Identificación de Haploides

Varios procedimientos facilitan la búsqueda de haploides en muestras grandes de individuos. Algunos de ellos son:

• Morfología: las plantas haploides son, en general, más pequeñas que las diploides, tanto en sus partes vegetativas como florales. Esto se debe principalmente a la disminución en el tamaño de sus células. Es lógico pensar que el fenotipo más pequeño de las plantas puede ser una primera aproximación en la búsqueda de haploides. Si esta disminución de tamaño fuera notable en las semillas, sería muy fácil realizar una selección mecánica, aunque esto sucede en pocas especies.

• Poliembrionía: la presencia de poliembrionía facilita la detección de embriones haploides. No obstante, debe realizarse el control citológico correspondiente. El porcentaje de embriones gemelos observados varía con la especie y el genotipo.

• Genes marcadores: con este fin puede utilizarse cualquier par de alelos cuyos fenotipos dominante y recesivo sean fácilmente distinguibles. En la práctica, conviene utilizar marcadores que posean manifestaciones fenotípicas claras en semilla o en plántula y de esta manera hacer una selección más económica en tiempo y esfuerzo. Para identificar haploides en una variedad que se supone homocigota, se realizan cruzamientos con otra variedad que sea homocigota para el alelo alternativo. La mayor parte de la descendencia será heterocigota (diploide), con fenotipo dominante. Los individuos que aparezcan con el fenotipo recesivo serían haploides, obtenidos por partenogénesis o androgénesis, según sea el fenotipo recesivo materno o paterno, respectivamente.

Cultivo de Anteras: consiste en el cultivo de anteras inmaduras en un medio de inducción donde las microsporas competentes originarán callos, que serán luego transferidos a un medio apropiado para la regeneración de plantas. En algunas especies de dicotiledóneas el número de plantas obtenidas por cada cien anteras cultivadas es muy elevado. En cambio, en las gramíneas la técnica no ha sido tan exitosa. Sin embargo, los progresos en los métodos de cultivo in-vitro durante las últimas décadas han permitido obtener buenos resultados con gramíneas , aún en aquellas consideradas recalcitrantes. La capacidad de respuesta al cultivo de anteras, denominada capacidad androgénica, puede ser evaluada a través de la producción de callos y de plantas verdes, y su eficiencia es altamente dependiente de:

1. El genotipo: es quizás el factor más importante que afecta al cultivo de anteras.

En la naturaleza, la haploidía es controlada por el gen hap, llamado gen inhibidor de la haploidía. Existe suficiente evidencia que sugiere que la androgénesis in-vitro también está bajo control génico, y que este carácter puede ser transferido desde clones con alta respuesta a otros no respondedores. Se ha hallado variabilidad en la respuesta entre especies y aún dentro de ellas. En cebada y trigo los caracteres inducción de callos y regeneración de plantas son altamente heredables, y se ha sugerido que ambos caracteres estarían controlados por muchos genes. Por lo tanto, el mejoramiento de la capacidad androgénica no parece difícil, siendo la identificación de genotipos con gran capacidad de respuesta un paso indispensable para su incorporación en los bloques de cruzamiento.

2. El % de albinismo: la ocurrencia de plantas albinas representa un serio problema para la aplicación del cultivo de anteras en programas de mejoramiento de cereales.

La incidencia depende, no sólo de la especie, sino también de la variedad, citándose valores de 50, 70 y 100% para tres variedades diferentes de arroz.

Bernard (1980) ha sugerido que las altas temperaturas incrementan la diferencia entre la velocidad de replicación del material nuclear y el de las organelas, resultando en un desarrollo retardado o incompleto de los plástidos, lo cual conduciría a la producción de fenotipos albinos.

De acuerdo a este autor, el desarrollo de un sistema fotosintético funcional es promovido por el tratamiento con bajas temperaturas, aunque no siempre un pretratamiento con frío reduce incidencia de albinismo.

3. Las condiciones de crecimiento de las plantas donantes: la edad y las condiciones ambientales en que crecen las plantas afectan considerablemente la capacidad androgénica de las mismas.

Los factores ambientales más críticos son el fotoperíodo, la intensidad de luz, la temperatura, la nutrición y la concentración de CO2. Estos factores incidirían en la capacidad de producir las divisiones celulares morfogénicas que conducen al desarrollo de embrioides y la regeneración de plantas. Este último paso es crítico dentro de todo el proceso, es altamente dependiente de la calidad del callo, y está asociado fuertemente a toda la historia previa del cultivo. En general, se ha informado que la utilización de anteras de las primeras floraciones favorece la respuesta androgénica, mientras que las colectadas al final de la estación muestran una menor respuesta al cultivo, generando una menor cantidad de embrioides. En Brassica napus, el crecimiento de las plantas a bajas temperaturas mejora la producción de embrioides obtenidos a partir de anteras.

4. El estado de desarrollo de las microsporas: en la fase gametofítica de las plantas, que comienza luego de la meiosis, las microsporas sufren inicialmente una división mitótica asimétrica que da origen a dos células de distintos tamaños: la generativa (más pequeña y con un núcleo altamente condensado) y la vegetativa (más grande y con un núcleo difuso).

En las gramíneas, el núcleo generativose divide nuevamente originando dos núcleos espermáticos. Uno generará el endosperma triploide al fusionarse conlos dos núcleos polares del saco embrionario, mientras que el segundo fertilizará a la oósfera produciendo el cigoto diploide, que constituirá el primer paso de la nueva fase esporofítica. Los embrioides haploides se originan in-vitro a partir de una de las vías que se enuncian a continuación. Cuando la primera división mitótica de la micróspora es asimétrica, los haploides se originan por repetidas divisiones de la célula vegetativa, de la generativa o de ambas. En cambio, cuandola primera división mitótica es simétrica, ambas células resultantes contribuyen al desarrollo del haploide. Por lo tanto, una célula gamética masculina puede revertir su desarrollo gametofítico hacia el grano de polen y dar origen directamente a un nuevo individuo. En general, las microsporas que se encuentran en la primera división mitótica son las que mejor responden. Esto varía levemente con la especie vegetal, pero esta reversión no es posible luego de iniciada la deposición de almidón. El estadío más apropiado para los cereales es el de micróspora uninucleada media y tardía.

5. Los pretratamientos: distintos tipos de estrés aplicados durante el estadío adecuado pueden enmascarar el programa gametofítico e inducir la expresión de genes específicos del desarrollo esporfítico. Si bien las bajas temperaturas son consideradas como el mejor pretratamiento, también otros pueden estimular la androgénesis, como el calor, el choque osmótico, la centrifugación de las anteras o hasta una incisión en la parte superior de la inflorescencia donante. También se citan la poda, la pulverización con etrel, la irradiación, la reducción en la presión atmosférica, la anaerobiosis, el tratamiento en una atmósfera saturada de agua y la aplicación de gametocidas.

Las bajas temperaturas aplicadas sobre la planta madre, sobre las yemas florales jóvenes o sobre las anteras, generalmente estimulan la embriogénesis. El frío estimula la división mitótica simétrica de las microsporas. Esto se debería a una alteración en la orientación del huso que conduciría a una primera mitosis anormal del grano de polen.

Por otra parte, se ha mencionado que las bajas temperaturas retardan el envejecimiento de la pared de la antera, lo cual aumentaría la supervivencia y la viabilidad del polen. En general, las temperaturas citadas varían entre 2 y 10 ºC y la duración del tratamiento de 2 a 30 días. Es importante determinar la temperatura adecuada para cada especie vegetal, aún para variedades dentro de la misma especie. En algunas especies, tales como Capsicum annun, avena y algunos genotipos de trigo se ha logrado éxito con un choque con alta temperatura. Temperaturas de 30 – 35 ºC durante los primeros 1 a 4 días del cultivo ayudaron a inducir la androgénesis en varias especies de género Brassica.

6. La composición del medio de cultivo: es otro de los factores importantes para el éxito en el cultivo de anteras. No existe una recomendación general y las variaciones dependen de la especie a cultivar.

a) Medios de inducción: dos tipos de estrés, osmótico y nutricional, han sido identificados como causas disparadoras de la inducción de embriogénesis en las microsporas de mono y dicotiledóneas. En tabaco, el cultivo de las anteras en un medio carente de sacarosa durante los primeros 6 días de la etapa de inducción permitió una máxima respuesta androgénica. Los carbohidratos cumplen dos roles fundamentales en los medios de inducción, ya que actúan como osmolito y como nutriente. Los agentes gelificantes representan otro aspecto importante en la evolución de los medios de inducc ón.

Tradicionalmente se utilizó agar como gelificante de los medios de cultivo debido a su disponibilidad y bajo costo. Pero en 1973 se detectó una mejor respuesta androgénica en tabaco cuando las anteras fueron cultivadas en un medio solidificado con agar y suplementado con carbón activado. En medios líquidos la adición de Ficoll (polímero sintético desacarosa, inerte, no iónico y de alto peso molecular) incrementa la tensión superficial y la viscosidad del medio. De esta manera, las anteras y callos flotan sobre el medio líquido y se desarrollan en condiciones aeróbicas, permitiendo elevadas tasas de embriogénesis y de producción de plantas verdes. En cuanto a los reguladores de crecimiento, la mayoría de los cereales requiere de la presencia de auxinas y de citocininas en el medio de cultivo y las respuestas parecen depender de los niveles endógenos de tales reguladores. Por ejemplo, para lograr la inducción en trigo es indispensable el uso de 2,4-D en concentraciones de 1,5 a 2 mg/l. Existen otras sustancias que, adicionadas al medio de cultivo, ayudan en la estimulación de la androgénesis, como la glutamina y el inositol. También se citan otros compuestos inespecíficos como extracto de papa, de batata, de mandioca, de trigo germinado y de endospermas de arroz y de maíz. En ocasiones, si el medio es suplementado con leche de coco los granos de polen desarrollan directamente en embrioides.

b) Medios de regeneración: la variedad de medios de regeneración citada es menor cuando se la compara con la de los medios de inducción. Los más utilizados son modificaciones derivadas del medio MS, con concentraciones de carbohidratos similares a las utilizadas en los medios de cultivo de tejidos tradicionales (30g/l de sacarosa), utilizando agar (0,6%) como gelificante, auxinas menos poderosas, y un balance hormonal a favor de las citocininas

7. Las condiciones de incubación: las características ideales de cultivo son específicas para cada especie, y aún para cada genotipo dentro de una misma especie. Estas afectan particularmente la tasa de absorción final de nutrientes y la regeneración de plantas verdes. La duración e intensidad lumínica, la temperatura y la orientación de las anteras sobre el medio de cultivo pueden tener un efecto considerable en algunas especies.

El cultivo de óvulos es un procedimiento muy complejo debido a que la manipulación del material es difícil. El óvulo es una estructura delicada, muy pequeña, altamente hidratada, que puede ser dañada con suma facilidad. Es imprescindible realizar la microcirugía con rapidez para evitar que los tejidos sufran desecación durante el proceso. Pese a las dificultades de la técnica, en algunos cruzamientos interespecíficos como los realizados en papa, algodón y Hevea brasiliensis, se comprobó que el cultivo de óvulos completos es más exitoso para el rescate de embriones que el cultivo de los embriones aislados.

3.4.2 Variación somaclonal

El cultivo in vitro representa un momento de estrés para las células y tejidos vegetales y puede desencadenar procesos mutagénicos durante el establecimiento del explanto, la inducción de callo y la formación de embriones o vástagos durante el proceso de regeneración de plantas. Algunos de los cambios genéticos ocurridos en las plantas regeneradas pueden resultar variantes atractivas, con utilidad potencial en el mejoramiento vegetal para el desarrollo de nuevas variedades.

Larkin y Scowcroft (1981) llamaron variación somaclonal a los cambios ocurridos en las plantas regeneradas y que son transmitidos a la progenie. Asimismo cabe citar la ocurrencia in vitro de cambios reversibles que pueden modificar la expresión de ciertos genes. Estos cambios que no implican alteración en la secuencia nucleotídica se denominan “epigenéticos” (Madlung y Comai, 2004). Algunos autores los consideran variantes somaclonales mientras que otros sólo incluyen en la misma aquellos cambios que no revierten en ciclos sucesivos de reproducción sexual. Los mecanismos por los cuales ocurre la variación somaclonal no han sido completamente dilucidados. Sin embargo, se han propuesto varias causas de posible incidencia en la ocurrencia la misma. Entre esas causas se citan: el genotipo, la fuente de explante, el tiempo en cultivo, las condiciones y composición del medio de cultivo y la vía de regeneración. La comprensión de estas causas ayudaría a mejorar la interpretación de los procesos celulares de respuesta al estrés y permitiría definir cómo actúan en los procesos de evolución.

Entre los fenómenos que ocurren durante el cultivo in vitro se mencionan alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinación somática e intercambio de cromátidas hermanas, rearreglos génicos somáticos, activación de elementos genéticos transponibles, amplificación y metilación del ADN y cambios en el ADN de las organelas. Por ello, aunque los caracteres morfológicos (como por ejemplo el hábito de crecimiento, la morfología floral, etc.) son fáciles de evaluar, otros cambios no se manifiestan en variantes morfológicas evidentes. Una diferencia estructural en un producto génico puede no alterar su actividad biológica lo suficiente como para producir un fenotipo modificado, por lo tanto, la variación debe analizarse a varios niveles.

Los cambios producidos son generalmente indeseables, pero la aparición ocasional de variantes no encontradas en las poblaciones naturales y que representan una ventaja desde el punto de vista agronómico, permite utilizar este fenómeno en programas de mejora vegetal.

Se ha utilizado, en algunos casos, para conferir caracteres deseables a cultivares de importancia económica, entre los que se incluyen: resistencia a enfermedades, tolerancia a suelos ácidos y a salinidad. El desarrollo de nuevos cultivares por esta técnica involucra un balance entre la cantidad de variación inducida y el mantenimiento de los caracteres agronómicos del cultivar.  Si bien desde el punto de vista práctico no es una técnica muy eficiente, dado que no es posible predecir ni dirigir el tipo de variación y se hace menester trabajar con poblaciones grandes de plantas, es necesaria la compresión del mecanismo para evitarlo en casos donde se requiere fidelidad genética, como en la micropropagación, la conservación de germoplasma y la transformación de plantas.

En algunos casos puede representar una fuente de variación rápida y de fácil acceso para ser utilizada en programas de mejoramiento, especialmente para especies con sistemas genéticos limitados o de base genética estrecha, como en el caso de la apomixis, donde la variabilidad dentro de las poblaciones naturales o cultivadas puede ser limitada.

Los primeros casos de variación somaclonal se registraron en plantas de reproducción agámica como la caña de azúcar y la papa, pero el fenómeno ha sido observado en monocotiledóneas como trigo, maíz, avena, arroz, pasto miel (Paspalum dilatatum) y pasto llorón (Eragrostis curvula) y en dicotiledóneas como tabaco, tomate, zanahoria y col, entre muchas otras especies.

Factores relacionados con la aparición de variación somaclonal

Hemos mencionado, previamente, algunos de los posibles factores que tienen influencia en la aparición de variación somaclonal. En este punto trataremos cada uno por separado.

Genotipo. En general se asume que la frecuencia de cambios dependerá de variaciones preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen entre el mismo y el proceso de cultivo. En arroz, ciertas variedades estables muestran niveles de variación que oscilan entre el 0 y el 1%, mientras que en otras, consideradas inestables, oscilan entre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especie ornamental, la variación somaclonal es genotipo dependiente y se la utiliza como una herramienta para la obtención de variedades. El nivel de ploidía del genotipo es otro factor a tener en cuenta. Por ejemplo en raigrás y en papa se observó que, durante el cultivo de tejidos, las variedades diploides muestran estabilidad, mientras que las tetraploides tienden a generar aneuploidías.

La explicación más razonable para este hecho es que los poliploides, con más de dos juegos completos de cromosomas, están “tamponados”, y por lo tanto toleran la ganancia o pérdida de cromosomas, pudiendo así cumplir con los requisitos impuestos por la regeneración. En los diploides, la pérdida o la alteración de cromosomas que llevan genes vitales impedirá la regeneración de las plantas, llegando con éxito a esta etapa sólo aquellos explantes que tengan su complemento cromosómico completo. Existen evidencias de una mayor inestabilidad en híbridos interespecíficos cultivados in vitro, si se los compara con las especies parentales.

Explante. La variación observada entre plantas regeneradas puede ser una consecuencia de quimerismo en el explante original.

Las quimeras son mosaicos genéticos. Esto significa que dentro de una misma planta existen diferentes linajes celulares, esto se debe a una serie de cambios en el ADN nuclear de ciertos tipos celulares producidos durante el desarrollo. Si estos tejidos se utilizan como explantos y sus células son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes líneas celulares pueden dar origen a plantas genéticamente diferentes. Por lo tanto, la utilización de explantos con tejidos quiméricos preexistentes puede resultar en una fuente “extra” de variación. Sin embargo, la recuperación de quimeras a partir de explantos no quiméricos es un fenómeno frecuente que puede ocurrir, a partir de procesos organogénicos, o por causas desconocidas. La utilización de explantos con tejidos organizados, como esquejes radicales o caulinares, es una buena opción si es necesario mantener estabilidad genética durante el cultivo in vitro. Sin embargo, diferentes genotipos reaccionan de manera distinta, aún con explantos “seguros”. El cultivo de meristemas aislados minimiza el riesgo de variación somaclonal. Esto no debe tomarse como regla, ya que utilizando técnicas moleculares fue posible detectar variación en plantas de frutilla y paraíso obtenidas a partir de meristemas. El cultivo de protoplastos parecería inducir inestabilidad genética, como fue observado en papa y tabaco; esto se ha asociado a los mayores tiempos en cultivo involucrados en la regeneración de plantas a partir de explantos tan pequeños.

La vía de regeneración también tiene un rol importante en la ocurrencia de alteraciones en plantas obtenidas in vitro. En especies de los géneros Pennisetum, Panicum, y Lolium la variación observada en cultivos embriogénicos fue relativamente menor que la que obtenida en cultivos organogénicos. Esto probablemente se debe a la gran presión de selección impuesta en la formación de los embriones, mayor que la requerida en la formación de vástagos. Se cree que el gran número de genes requeridos para la iniciación y maduración de embriones cigóticos y somáticos impediría la acumulación de mutaciones deletéreas. Sin embargo, también se observaron variantes en plantas de café, apio y caña de azúcar regeneradas a través de embriogénesis somática. En estos casos se advirtió que algunos fenotipos anormales de embriones somáticos se asemejan a los mutantes del desarrollo embrionario obtenidos en Arabidopsis y maíz.

La mayor parte de la variación obtenida in vitro parece provenir de la fase de callo. Los mecanismos de iniciación de un callo parecen ser similares a la respuesta de las plantas a heridas, que se sabe que activan elementos transponibles y estimulan la inducción de enzimas y productos específicos de situaciones de estrés. La desdiferenciación que ocurre durante la inducción del callo, altera procesos celulares que resultan en cambios genómicos, uno de los más frecuentes es la inestabilidad cromosómica.

La naturaleza del callo también puede afectar el nivel de variación obtenida. Un callo verdadero es una masa de células desdiferenciadas que proliferan desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variación. En varias monocotiledóneas el callo representa, a menudo, una masa de órganos suprimidos o proembriones más que un tejido completamente desorganizado. Este tipo de callo mantiene un alto grado de estabilidad genética, como se ha observado en espárrago.

El estado físico del medio de cultivo también nfluye en el nivel de variación obtenida. Un mismo explante puede tener diferente comportamiento si se lo cultiva en medio sólido o en medio líquido. Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotípica y/o incrementar el número de plantas albinas y también la deficiencia de oxígeno que se genera durante el transcurso del cultivo. La tensión de oxígeno a la que están expuestas las células superficiales del callo es diferente a la de las células situadas en profundidad.

La anaerobiosis resultaría en la producción de etanol, el cual podría comportarse como un mutágeno. Un efecto similar podría tener la acumulación de metabolitos producidos por las propias células durante el cultivo.

Los reguladores de crecimiento, principalmente el 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético), han sido señalados como inductores de inestabilidad. Estos ejercen profundos efectos sobre la respiración celular, el consumo de azúcares y en el control de la división celular. Por ello se especula acerca de su rol indirecto en la inducción de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in vitro. Aparentemente el 2,4-D induce desdiferenciación y provoca un incremento sustancial en la transcripción. Esto puede alterar la estructura de la cromatina, por lo cual se lo utiliza en gramíneas como inductor de aneuploidías. La relación auxina:citosina también suele afectar en este sentido. El 2,4-D, el AIA (ácido indolacético) y el ANA (ácido naftalenacético) han sido señalados como los responsables de los incrementos en la metilación de las citosinas, que tienen lugar durante el cultivo in vitro. Los sectores del ADN donde las citosinas se encuentran metiladas en posición 5 son considerados puntos calientes de mutación, ya que la desaminación de una 5-metilcitosina resulta en un cambio de citosina a timina. Un estudio realizado en papa indicaría que el tipo y la concentración de los reguladores de crecimiento en los estadios iniciales de cultivo in vitro no generaría variación genética. Los efectos serían más importantes durante el crecimiento del callo y la iniciación de los vástagos. Estos datos sugieren que la fase de callo sería un período sensible en el cual la manipulación hormonal afecta la estabilidad de las plantas regeneradas; de manera que las hormonas inducirían inestabilidad genética sin ser, necesariamente, el origen de la misma.

La deficiencia o exceso de minerales en el medio de cultivo podrían ser causa de variación. Este fenómeno se ha observado también en plantas creciendo en condiciones de campo. Un ejemplo típico lo constituyen plantas de lino sometidas a exceso o deficiencias de azufre, nitrógeno, fósforo, calcio y magnesio. En estas plantas se observaron cambios genómicos estables y heredables. En este caso los cambios fueron inducidos por una fertilización excesiva del suelo, obteniéndose así líneas estables, denominadas “genotrofos”, caracterizadas por diferente contenido de ADN nuclear y citoplasmático.

La edad del cultivo es otro factor que afecta el nivel de variación, aumentando la proporción de variantes en cultivos envejecidos y también en plantas obtenidas a través de varios subcultivos. Esto se ha observado en ajo, maíz, avena, tabaco, triticale y raigrás triploide. La variación puede minimizarse realizando subcultivos frecuentes de explantos jóvenes.

Cambios genómicos producidos durante el cultivo de tejidos: Las plantas poseen una amplia capacidad de acomodarse a las situaciones cambiantes de su entorno, pero en algún momento esa capacidad de amortiguación se vuelve deficiente y los organismos caen en un estado de crecimiento subóptimo que parece inducir mecanismos de cambios genómicos. Las bases metabólicas de la interacción entre el estrés y estos cambios son desconocidas. Sin embargo, en la literatura se menciona la posibilidad de ocurrencia de alteraciones a nivel del ADN a consecuencia de diferentes estreses ambientales, dependiendo de la intensidad del estrés y del estado de diferenciación de las células, en el momento de experimentarlo. Estos cambios ocurrirían, en parte, debido a una pérdida del control del ciclo celular. Entre las alteraciones genéticas se citan mutaciones puntuales, cambios en la estructura o el número de cromosomas y activación de elementos genéticos transponibles. Estos últimos causan reorganizaciones moleculares, no solo por su transposición, sino también porque generan amplificaciones y deleciones.

El cultivo in vitro también incrementa la frecuencia de intercambio entre cromátidas hermanas o “crossing over" somático. Varias hipótesis han intentado explicar y relacionar la serie de eventos que tienen lugar durante el cultivo in vitro, como son las perturbaciones del ciclo celular, las aberraciones cromosómicas estructurales y numéricas, la activación de transposones y las mutaciones génicas. Kaeppler y Phillips (1993) proponen la existencia una base molecular común para todos estos eventos mutagénicos que comprendería una alteración en los patrones de metilación del ADN.

En cuanto a los cambios en el número de cromosomas, la poliploidía es el más común de estos fenómenos, y estaría relacionada confallas en la mitosis, mientras que la aneuploidía puede surgir por segregación desigual en la mitosis o por fragmentación nuclear, seguida de mitosis.

La variación somaclonal también puede afectar el genoma de los plástidos y las mitocondrias. En plantas de sorgo androestériles obtenidas in vitro se observó restauración parcial de la fertilidad y en plantas androestériles de maíz con citoplasma “ T ” (que eran, además, susceptibles a Helminthosporium maydis) hubo reversión de la androesterilidad y de la susceptibilidad al patógeno. Estos cambios se correspondían con mutaciones en el ADN mitocondrial. Otro caso de variación debida al cultivo in vitro es el albinismo, problema que se presenta frecuentemente en el cultivo de anteras de Gramíneas. En plantas albinas de trigo obtenidas por cultivo de anteras se observaron deleciones y rearreglos en el ADN de los cloroplastos. Si bien parecería que los tejidos somáticos son menos sensibles a la variación, también se ha observado albinismo en plantas regeneradas a partir de los mismos.

La ocurrencia de variación somaclonal puede detectarse con marcadores morfológicos, bioquímicos y moleculares. La correlación de dichos marcadores con caracteres agronómicos es un requisito relevante para su implementación en los programas de mejoramiento.

La utilización de marcadores morfológicos para detectar variantes somaclonales ha sido exitosa desde el punto de vista del mejoramiento y citada en varios trabajos de investigación.

A nivel fisiológico, tanto en cereales como en frutales se detectaron y seleccionaron variantes que presentaron resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, sales y condiciones de acidez en el suelo, entre otros. Estos estudios se basaron en la utilización de altas presiones de selección durante la regeneración, mediante la adición de agentes selectivos en el medio de establecimiento y regeneración, como inóculos, toxinas, herbicidas, condiciones de pH extremas o concentraciones salinas elevadas.

El estudio del cariotipo permite revelar cambios en el número de cromosomas (poliploidías, aneuploidías) y en la estructura de los mismos (translocaciones, inversiones, deleciones y duplicaciones). Las alteraciones cariotípicas constituyen una fuente importante de variación, que muchas veces es subestimada cuando se trabaja con métodos tradicionales de conteo cromosómico. Las técnicas de bandeo cromosómico brindan más información acerca de la estructura cromosómica y las alteraciones que pueden surgir en este sentido.

La hibridación in situ es otra de las técnicas que permiten examinar los cariotipos de una forma más exacta y resulta particularmente útil para revelar anormalidades en la estructura de los cromosomas.

Algunas de las ventajas que presenta la variación somaclonal pueden resumirse de la siguiente manera:

• Es una técnica poco costosa: requiere de un laboratorio de rutina y facilidades de campo.

• Constituye una forma rápida de generar variabilidad genética, particularmente para cultivos con base genética estrecha y que son difíciles de mejorar a través de técnicas tradicionales.

• Es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien adaptados. • Puede utilizarse para mejorar especies de propagación sexual y vegetativa.

• Las tasas de mutación son relativamente elevadas si se comparan con las tasas de mutaciones espontáneas. La variación somaclonal ocurre con una frecuencia de 1 mutación cada 100 plantas regeneradas, en contraste con la tasa esperada de mutación espontánea de 10-7 – 10-9 mutaciones por par de nucleótidos por generación.

• El conocimiento de las condiciones que generan inestabilidad genética durante el cultivo in vitro, permitiría utilizar el fenómeno como estrategia de mejoramiento y permitiría eludirlo en aquellos casos en que se requiera estabilidad genética.

• El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan mutágenos químicos o físicos, ya que, en el caso de la variación somaclonal, la mayoría de los cambios deletéreos producidos son eliminados por el filtro que representa la regeneración de plantas.

Entre las desventajas cabe mencionar:

En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa de laboratorio o invernáculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia práctica.

• La baja tasa de regeneración de plantas en cultivos de largo término. Generalmente en estos casos existe pérdida de la capacidad morfogénica.

• La regeneración está limitada a genotipos específicos que pueden no ser de mucho interés para los mejoradores.

• Algunos somaclones son inestables (variación epigenética).

• Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploidía, esterilidad, etc.

Desde el punto de vista productivo y comercial, una variante somaclonal debería cumplir los siguientes requisitos:

• Involucrar caracteres agronómicamente útiles.

• El nivel de expresión del carácter debe superar al de sus progenitores.

• El carácter mejorado debe estar combinado con todos los otros caracteres agronómicos de la variedad que son importantes para el cultivo.

• La variación debe ser heredable y estable (sin reversión) en la progenie. En general, los mejoradores buscan en los somaclones caracteres de importancia práctica. El recurso es utilizar cultivares altamente adaptados para modificar unos pocos caracteres, ya que resulta más sencillo mejorar selectivamente una variedad de uso corriente que crear una nueva.

3.4.3 Fusión de protoplastos

Fusión de protoplastos: al fusionar dos protoplastos haploides se origina uno diploide que puede duplicarse y llevar a la obtención de un híbrido interespecífico o intergenérico, siendo esto una ventaja importante cuando se trabaja en hibridación somática.

Cuando no se encuentran respuestas rápidas con tejidos u órganos, se requiere aislar células individualmente con el fin de estimular directamente su condición totipotente. Un protoplasto es una célula carente de su pared celular. Esta técnica es interesante porque podría ser un medio de multiplicación vegetativa de potencial muy alto, sin embargo el riesgo de obtención de mutantes a partir de los cultivos de protoplastos es relativamente elevado y la puesta en marcha de esta técnica es más delicada. Los medios para el cultivo de protoplastos siguen el modelo de los utilizados para el cultivo de células in vitro y son modifi caciones de los medios de Murashige y Skoog (1962) o de Gamborg (1968). Entre las formulaciones con mayor éxito para diferentes sistemas de protoplastos se encuentra la de Kao y Michayluk (1975).

En teoría es posible aislar protoplastos de cualquier tipo de planta, órgano o tejido, sin embargo las fuentes más utilizadas son: mesófilo, células en suspensión, callos y ápices de plántulas generadas in vitro. También se han obtenido protoplastos del endospermo, la capa de aleurona, coleóptilo, ápices radiculares, nódulos de raíz, tubérculos, pétalos y microsporas.

Los protoplastos son capaces de fusionarse entre sí gracias a la acción del PEG (polietilenglicol, del 15 al 30%). La fusión de dos células con 2N cromosomas lleva teóricamente a la obtención de una célula con 4N cromosomas. Los híbridos así obtenidos son híbridos vegetativos (no se utiliza la vía sexual), también llamados híbridos somáticos. Ejemplos: En 1972, una fusión entre dos protoplastos de Nicotiana glauca y Nicotiana langsdorfi ha originado un híbrido somático semejante en todos los aspectos al híbrido sexual originado el mismo a partir de estas mismas especies.

La fusión somática entre la patata y el tomate nos da el pomate, híbrido que presenta caracteres intermediarios de los dos padres; planta extraordinaria de laboratorio, pero que no es importante comercialmente.

Sin embargo, los éxitos están lejos de ser muy importantes y el nivel de fracasos es elevado pues la fusión de dos células somáticas puede dar resultados muy variados:

1. Los núcleos y los citoplasmas se fusionan, pero desaparecen cromosoma. Se obtiene un híbrido somático aneuploide estéril.

2. Núcleos y citoplasmas se fusionan sin pérdida de cromosomas: es el híbrido somático con 4N cromosomas fértil.

3. Se fusionan los citoplasmas, pero no los núcleos, se obtiene entonces un híbrido somático con el núcleo de los padres y un citoplasma híbrido. Se emplea en ocasiones el término cybrido para designar este híbrido somático.

4. Todas las soluciones intermedias son posibles con fusiones parciales de los núcleos o de los citoplasmas. Aunque los éxitos hortícolas son todavía muy poco numerosos, esta técnica abre perspectivas variadas y portadoras de esperanzas.

3.4.4 Aplicación agronómica

La variación somaclonal y su aplicación en el mejoramiento genético

La base del mejoramiento genético es la optimización de las interacciones génicas. Para lograr combinaciones génicas óptimas o superiores se requiere de diversidad genética. Esta diversidad, que se encuentra normalmente en las poblaciones de individuos, puede provenir de cruzamientos sexuales, mutaciones inducidas (físicas o químicas o producidas por ADNT, por elementos transponibles o retrotrasposones), hibridación somática y transformación genética. La variación somaclonal proporcionaría una fuente adicional de variabilidad genética, potencialmente útil en programas convencionales de mejoramiento.

En las plantas autógamas, con los métodos convencionales de mejoramiento, la homocigosis práctica se logra recién luego de seis a ocho generaciones de autofecundación. Mientras que con una técnica de producción de haploides seguida de duplicación cromosómica, es posible llegar a homocigosis completa en solo una generación.

• En las plantas alógamas, la producción de homocigotas resulta de gran importancia. Al trabajar con especies de polinización cruzada se favorece naturalmente la heterocigosidad, y, de ser posible la autofecundación, la obtención de homocigotas se ve dificultada por la endogamia.

• En plantas bulbosas, árboles frutales y forestales la homocigosis juega un rol muy importante en el aceleramiento de los programas de mejora. Debido al prolongado tiempo requerido para alcanzar la fase adulta, el proceso de mejora resulta extremadamente largo, aún siendo posible la autopolinización.

3.5 Conservación In Vitro

La conservación de la biodiversidad constituye un objetivo prioritario en un escenario en que las relaciones entre el desarrollo tecnológico y la conservación del ambiente ocupan crecientemente el debate público. En particular, la conservación de los recursos fitogenéticos de interés para la agricultura es un factor ampliamente reconocido para contribuir al desarrollo sostenible de la misma y a la conservación de los recursos naturales. Uno de los ventajas más destacables del cultivo de tejidos in vitro es su posibilidad de propagar a gran escala cualquier material vegetal con mínimo riesgo de introducir o reintroducir patógenos y con alto grado de estabilidad genotípica. Por esta razón, han encontrado sus aplicaciones en la conservación e intercambio de recursos fitogenéticos se ha incrementado aceleradamente.

La ausencia de producción de semillas y, como alternativa, la propagación clonal en algunas especies indujo la exploración del cultivo de tejidos vegetales como una posibilidad de conservación (Whiters, 1989). Cultivo in vitro de plantas es una denominación genérica para un conjunto de técnicas que tienen como característica el uso de células, tejidos u órganos como material para propagar el germoplasma, manteniéndolo viable en condiciones asépticas en recipientes que contienen un medio de cultivo sintético, incubado en condiciones me­dioambientales controladas.

Esta estrategia presenta ventajas diferentes a las de las colecciones vivas en campo: proporciona mayor seguridad al germoplasma en conservación (al tenerlo confinado en instalaciones seguras, en resguardo y vigilancia constantes) ante el efecto de desastres naturales y eventualidades que en campo no pueden ser controladas; mantiene el germo­plasma libre de patógenos por medio de su propagación en condiciones asépticas y la limpieza de material biológico de microorganismos por cultivo de meristemos y/o combinación con otros tipos de métodos como la termoterapia; permite un mayor número de accesiones al mantener en recipientes pequeños una gran cantidad de individuos miniaturizados y tejido germinal. Las condiciones de asepsia y tejidos libres de patógenos proporcionan adicionalmente una mayor ca­pacidad de movilidad para el intercambio internacional de germoplasma fiel al tipo, simplificando los procedimientos cuarentenarios.

3.5.1 Aspectos importantes en la conservación in Vitro

Tradicionalmente, la conservación de recursos fitogenéticos se ha basado en dos metodologías: ex situ e in situ. La conservación ex situ incluye al cultivo de células y/o tejidos vegetales (bancos de germoplasma in vitro). Los métodos de conservación in situ contemplan la preservación de las especies de interés en su hábitat natural. La criopreservación consiste en la conservación a temperaturas ultra bajas (-196°C) en un medio criogénico como el nitrógeno líquido. Durante las últimas décadas se ha avanzado mucho en el estudio de la respuesta del material vegetal a bajas temperaturas. Como parte de ello, se han estudiado los procesos fisiológicos y bioquímicos involucrados en la criopreservación y se han investigado las condiciones que posibilitan la preservación de la viabilidad del material vegetal almacenado por este método.

Los bancos de germoplasma in vitro posibilitan el mantenimiento a largo plazo de material vegetal en medios sintéticos de cultivo, bajo condiciones controladas de luz, fotoperíodo y temperatura. El manejo de este material no difiere demasiado de los procedimientos generales utilizados para la micropropagación vegetal. Ciertas variables, tales como la concentración de los compuestos osmóticamente activos, la concentración del agente gelificante inerte, la temperatura de cultivo y la luz, son ajustadas de manera de determinar una disminución de la tasa metabólica del material vegetal. De esta manera, se logra minimizar la manipulación y espaciar los subcultivos, lo que contribuye al descenso de los costos de mantenimiento. Una práctica general consiste en disminuir la intensidad lumínica y reducir la temperatura. Bajo estas condiciones restrictivas (por ejemplo, en oscuridad y a 4°C), es posible conservar plántulas de Fragaria x ananassa (frutillas o fresas) durante años, con el agregado esporádico de gotas de medio de cultivo fresco al material en conservación. Las condiciones estándar de cultivo in vitro sólo pueden utilizarse para conservación a mediano plazo de especies de crecimiento lento, como por ejemplo Coffea arabiga. Las plántulas de café micropropagadas pueden ser conservadas en un medio de cultivo estándar a 27°C, sin necesidad de ser repicadas o subcultivadas periódicamente a medio fresco, durante un año.

3.5.1.1 Regeneración

En condiciones de cultivo in vitro, las células somáticas pueden regenerar embriones o brotes, raíces y/o flores como respuesta a un determinado estímulo. La regeneración es un proceso que comprende diferentes fases que se suceden de manera similar para los tres tipos de morfogénesis citadas. De Klerk y colaboradores, en 1997, denominaron a estas diferentes fases como adquisición de la competencia; fase de inducción y fase de realización. En la primera fase, las células no responden al estímulo organogénico pero adquieren esa competencia durante una fase de desdiferenciación. En la segunda fase o fase de inducción, las células son receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación directa con el tipo, concentración y combinación de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase de realización, la célula sufre las sucesivas divisiones para formar el órgano determinado.

A partir de la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones de cultivo adecuadas, puede inducirse la formación de nuevos órganos de manera directa, sin la formación de callo. Si la formación es de brotes, raíces o flores se denomina organogénesis directa. Si en cambio se induce la formación de embriones somáticos, este proceso se denominará embriogénesis directa. Si por el contrario, a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferación de células en forma desordenada y sin ninguna función predeterminada, se iniciará la producción de callos o suspensiones celulares. La diferenciación de órganos a partir de callos, denominada morfogénesis indirecta, estará condicionada a la previa formación de los meristemoides. Morfogénesis directa o indirecta fueron términos propuestos por Hicks en1980.

3.5.1.2 Variabilidad

La variabilidad genética es un hecho universal en las poblaciones reproductivas y una condición preliminar necesaria para el cambio evolutivo y para la respuesta al mejoramiento genético mediante selección o hibridación. Por otra parte son conocidos los peligros que implican la uniformidad y la falta de diversidad en las especies cultivadas y en los animales domésticos, como consecuencia de la erosión genética.

3.5.1.3 Estabilidad genética

Los sistemas de cultivo de tejidos presentan diferentes niveles de riesgo de variación. Así, por ejemplo los sistemas más estables son los cultivos de meristemos y la micropropagación nodal; les siguen los embriones somáticos y las yemas adventicias; por último, los más inestables en teoría, son los cultivos de células y protoplastos. 

3.5.1.4 Estrategias

Es grande el rango de especies vegetales cultivadas cuya conservación es accesible in vitro. La conservación de los recursos genéticos mediante los métodos de cultivo in vitro se logra haciendo cambios en el ambiente del cultivo para desacelerar o suprimir totalmente el crecimiento de las células y de los tejidos; el objetivo es aumentar al máximo el periodo de transferencia del cultivo o extenderlo indefinidamente.

A continuación se presenta un esquema sobre las estrategias de conservación in vitro utilizadas:

3.5.2 Métodos de conservación

La estrategia a seguir para la conservación de germoplasma, depende de la naturaleza del material vegetal, y está definida por la duración de su ciclo de vida, el modo de reproducción y el tamaño de sus individuos. De acuerdo con estas características se han intentado diversas alternativas de conservación, que van desde el tradicional banco de semillas hasta el mantenimiento de áreas de reservas. Sin embargo, en muchos casos el mantenimiento no es posible y en otros casos resulta sumamente costoso y los riesgos de pérdidas por manipulación o desastres naturales son muy altos. Por lo tanto, se buscó implantar nuevas estrategias para conservar los recursos genéticos en forma más eficiente.

Los métodos de conservación de germoplasma se pueden dividir en:

      - Métodos de Conservación in situ;

      - Métodos de Conservación ex situ.

Los primeros se basan en la conservación de las plantas en sus habitats naturales e incluyen la conservación en Parques Nacionales y en Reservas Ecológicas, los cuales requieren un considerable espacio físico, altos costos asociados a la necesidad de mano de obra especializada, control permanente de enfermedades y malezas, a la par que las plantas están expuestas a las inclemencias del clima y de los incendios.

Por otra parte, los métodos de conservación ex situ se basan en el mantenimiento del material biológico en bancos de semillas, bancos de cultivo in vitro, colecciones de plantas (en campo, viveros, jardines botánicos). En general, los bancos de semillas constituyen uno de los métodos más convenientes para la conservación de germoplasma ex situ, porque permiten almacenar una gran variabilidad genética en forma económica y práctica. Para la conservación de semillas la International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI) recomienda su desecación hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18ºC). Este protocolo de conservación es en general el más recomendado para la mayoría de las especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la desecación sin que ello implique pérdida de viabilidad. A las semillas que presentan estas características se las denominan “semillas ortodoxas” como por ejemplo las semillas de arroz, trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo, en ciertos casos este método de conservación no es aplicado, porque la especie se propaga, en la práctica, vegetativamente (como la mandioca, papa, caña de azúcar, plátanos y bananos) o bien porque sus semillas pierden rápidamente la viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecación. A estas semillas se las denominan “semillas recalcitrantes”. Las semillas de numerosas especies que viven en zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta categoría, como por ejemplo las de coco, cacao, frutales tropicales perennes y diversas palmeras.

Otro método de conservación de germoplasma ex situ, es mediante el cultivo in vitro de tejidos. El descubrimiento de la totipotencialidad  de las células vegetales y la posibilidad de desarrollar plantas normales y completas a partir de diferentes explantes, ha permitido pensar en el establecimiento de bancos de germoplasma utilizando el cultivo de tejidos vegetales. Algunos de los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma fueron realizados en mandioca en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y en papa en el Centro Internacional de la Papa (CIP). Recién en 1980 se reconoció el potencial de los métodos del cultivo in vitro para la conservación de especies de plantas "difíciles". Este término se refiere a las especies propagadas vegetativamente en forma obligada o que tienen semillas recalcitrantes. En estos casos, la conservación de los genotipos se realiza mediante el mantenimiento de plantas vivas o mediante el cultivo in vitro de ápices caulinares o de nudos.

3.5.2.1 Factores que limitan el crecimiento

El mantenimiento de los recursos fitogenéticos mediante los métodos del cultivo in vitro se logra haciendo cambios en el ambiente de cultivo para desacelerar el crecimiento de las células y de los tejidos. El objetivo es aumentar al máximo el período de transferencia del cultivo. Es esta necesidad la que estimuló algunos de  los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma de diversas especies. Este método cubre un amplio espectro de técnicas que implican el cultivo, bajo condiciones de asepsia, de órganos o fragmentos de órganos (meristemos, semillas, embriones somáticos, embriones cigóticos, hojas, tallos, raíces, yemas, polen, anteras, callos o protoplastos), en un medio de cultivo artificial definido, bajo condiciones ambientales controladas.

Entre los factores que limitan el crecimiento y que ayudan a la conservación de germoplasmas, son principalmente: la reducción de la temperatura y de las condiciones de luminosidad.

3.5.2.2 Supresión del crecimiento

La supresión del crecimiento se ha logrado al modificar el medio de cultivo, adicionando al mismo inhibidores osmóticos o retardantes del crecimiento, deshidratadores de tejido o modificar la fase gaseosa del recipiente de cultivo. La modificación de uno o más de estos factores es usada para la conservación de numerosas especies, como por ejemplo para la conservación de microestacas de Manihot esculenta; de vástagos de especies de Fragaria, Ipomoea, Rubus, Musa, Saccharum, Zingiber, Ananas, Coffea, Dioscorea y de microtubérculos de Solanum. Estas técnicas de almacenamiento se realizan a mediano plazo, es decir, se basan en reducir el metabolismo celular y con ello reducir el crecimiento y el número de subcultivos durante meses hasta un año, sin que ello afecte la viabilidad de los cultivos.

3.5.2.3 Cryoconservación del germoplasma

En el Laboratorio de Cultivo in vitro del Instituto de Botánica del Nordeste (IBONE), en la Facultad de Ciencias Agrarias de la UNNE, desde hace varios años se llevan a cabo experimentos referidos a la conservación de germoplasma de paraíso (Melia azedarach). Utilizando como explantes meristemos de clones selectos de paraíso mantenidos durante 12 meses a tasas de crecimiento reducidas (medios de cultivo subóptimos o empobrecidos y en condiciones de oscuridad se logró mantener con éxito y regenerar plantas de paraíso que actualmente se encuentran en evaluación a campo (Fig. 1). Asimismo en el IBONE, se realizan experimentos tendientes a optimizar las técnicas de conservación in vitro a largo plazo que consisten en el almacenamiento a temperatura del nitrógeno líquido (-196ºC) –crioconservación- con lo cual se consigue la supresión del crecimiento hasta llegar a un estado de "suspensión animada".

Las técnicas de conservación de germoplasma mediante el uso de la crioconservación ofrecen varias ventajas en relación con las técnicas tradicionales de conservación, pues permiten la conservación a largo plazo (años), presenta bajos costos de mantenimiento, una fácil manipulación de las muestras y no dependen del suministro eléctrico. Desde que en 1968 se informara acerca de la crioconservación de células de lino y luego de los resultados satisfactorios que se obtuvie ron con la crioconservación de meristemas de frutilla en el Instituto de Biotecnología de Plantas en Sakatoon - Canadá, se iniciaron en 1985 algunas investigaciones colaborativas entre el CIAT y el IPGRI para desarrollar esta técnica con el cultivo de meristemas de mandioca. A partir de estos estudios, numerosos trabajos dan muestra de la importancia de esta técnica, de sus usos y aplicaciones.

La crioconservación consta de siete pasos:

    Selección del material a crioconservar: Cuando se realiza la selección del material a crioconservar, se debe tener la absoluta seguridad de que a partir del mismo se obtienen plantas completas. El explante seleccionado depende del objetivo de conservación y está estrechamente relacionado con el tipo de pro pagación de la especie. Por ejemplo en el caso de la mandioca, la cual se propaga principalmente por vía asexual (mediante estacas), se conserva su germoplasma in vitro en el CIAT mediante el cultivo de microestacas y también de meristemas con lo cual paralelamente a la conservación se consigue el saneamiento de los cultivares. Además, se están realizando estudios para la crioconservación de meristemas.

    Deshidratación: La deshidratación del explante es un paso crucial para el éxito de la crioconservación, ya que es necesario eliminar toda el agua libre presente en el tejido vegetal, minimizando así las posibles pérdidas por congelación. La deshidratación del tejido puede realizarse en una cámara a 0ºC o en cámaras herméticamente cerradas utilizando sustancias higroscópicas como por ejemplo: silica gel, glicerol (5 - 20%), o sometiendo al explante a una corriente de aire en un flujo laminar de aire estéril.

    Aclimatación: La aclimatación se puede realizar en forma rápida o lenta. La aclimatación rápida consiste en colocar el explante directamente en el nitrógeno líquido, con o sin la adición exógena de crioprotectores; mientras que la aclimatación lenta se realiza bajando gradualmente la temperatura (0.1-3ºC/min.). Este punto debe ser manejado cuidadosamente pues una deshidratación excesiva de las células puede exponerlas a una alta concentración interna de los solutos. Por esta razón generalmente el material se congela lentamente, a una velocidad adecuada hasta alcanzar una temperatura próxima a los -40ºC y luego se lleva a nitrógeno líquido (-196ºC). Para preparar (aclimatar) al explante a las bajas temperaturas se utilizan sustancias crioprotectoras como azúcares (sacarosa, glucosa); alcoholes (glicerol, etilenglicol, manitol y sorbitol), DMSO, PVP, o también pueden utilizarse soluciones de vitrificación, que son una combinación de crioprotectores tal como el PVS2. Tanto los crioprotectores como las soluciones de vitrificación actúan fundamentalmente como agentes anti-congelantes, aumentando la viscosidad del tejido vegetal y reduciendo la permeabilidad de las células.

    Almacenamiento: De acuerdo al material vegetal que se utilice, se presentan dos grandes sistemas:

-Sistemas Secos: comprende todos aquellos tejidos vegetales endógenamente resistentes y tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratación.

-Sistemas Hidratados: son todos aquellos tejidos vegetales no tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratación por lo que se requiere una protección exógena. Esta protección puede estar dada por el uso de crioprotectores o bien por la utilización de soluciones de vitrificación.

Los sistemas secos, por ser más resistentes necesitan menor preparación para su almacenamiento y comprende aquellas especies que habitan zonas frías y/o templadas. En cambio, los sistemas hidratados son más susceptibles al frío y están representados por todas aquellas especies que habitan zonas tropicales y subtropicales, las cuales no están adaptadas para soportar temperaturas inferiores a 0ºC, por este motivo estos tejidos deben ser protegidos exógenamente mediante el uso de crioprotectores.

    Descongelamiento y Rehidratación: Cuando se desea recuperar al explante del nitrógeno líquido, se puede realizar un descongelamiento rápido a Baño María (generalmente 1-2 min. a 30 ó 40ºC) o en forma lenta sometiendo al explante a temperatura de laboratorio o a una corriente de aire en el flujo laminar de aire estéril.

En la última década, han surgido numerosas técnicas que combinan el uso de crioprotectores y de soluciones de vitrificación con técnicas de deshidratación y encapsulación, las cuales básicamente pueden resumirse en técnicas de:

Encapsulación-Deshidratación: La técnica de encapsulación-deshidratación esta basada en el desarrollo de la metodología aplicada a las semillas sintéticas, en la cual un explante es recubierto por una matriz de alginato de sodio y polimerizado en una solución de cloruro de calcio formando un gel alrededor del explante de alginato de calcio. Una vez llevada a cabo la encapsulación, se realizan pre-tratamientos generalmente con sacarosa (desde 0.3 hasta 1.5M), que actúa como crioprotector del explante. En especies tolerantes al frío, la exposición de las plantas madres a bajas temperaturas durante varias semanas previas a la criopreservación, incrementa la supervivencia. La deshidratación puede llevarse a cabo sometiendo las cápsulas de alginato (conteniendo a los explantes) a una corriente de aire en el flujo laminar o exponiéndolas en cámaras herméticamente cerradas con silica gel. Las cápsulas así deshidratadas pueden ser llevadas directamente a inmersión en nitrógeno líquido o bien a un descenso lento de temperatura.

Vitrificación: Esta técnica, involucra el pre-tratamiento de las muestras con soluciones de vitrificación. Ejemplos de estas soluciones muy utilizadas en el mundo son el PVS2 o bien otra compuesta por 40% etilenglicol, 15% sorbitol y 6% albúmina sérica bovina. Luego de la exposición a las soluciones de vitrificación (generalmente a una temperatura de 0ºC para disminuir los riesgos de fitotoxicidad), las muestras pueden ser sumergidas directamente en nitrógeno líquido o llevadas a un descenso lento de temperatura. Las soluciones crioprotectoras usadas en los protocolos de vitrificación, son generalmente tóxicas para las células y el tiempo de exposición a la solución debe estar relacionado con el tamaño del explante y la misma debe ser removida rápidamente luego del descongelado.

Encapsulación-Vitrificación: La técnica de encapsulación-vitrificación, es una combinación de las técnicas de encapsulación-deshidratación y vitrificación. Las muestras son encapsuladas en alginato de calcio y sometidas a vitrificación durante el enfriamiento. Comparada con la técnica de encapsulación- deshidratación tiene un 30% más de supervivencia. Esto puede explicarse debido a que las cápsulas de alginato de calcio reducen la toxicidad de las soluciones de vitrificación.

Desecación: La técnica de desecación es un proceso muy simple que sólo requiere la deshidratación del material vegetal, la cual es crucial para el éxito de la crioconservación. Esta técnica consiste en someter al explante a una corriente de aire en un flujo laminar o en cámaras herméticamente cerradas conteniendo silica gel; luego de lo cual se realiza un enfriado rápido, sumergiendo el material directamente en nitrógeno líquido.

Precultivo:  La técnica del pre-cultivo, involucra la incorporación de crioprotectores (durante distintos tiempos que dependen del explante) antes del enfriamiento; como por ejemplo la adición de altas dosis de sacarosa para la crioconservación de meristemas de Musa spp.; la utilización de PEG y DMSO en embriones cigóticos de Triticum aestivum y Phaseolus vulgaris; la utilización de sacarosa y DMSO o glicerol en semillas, embriones cigóticos, polen y anteras de Oryza spp. y la utilización de ácido abscísico para la conservación de líneas celulares y de callos de Oryza sativa.

Precultivo-Desecación: Esta técnica es una combinación de dos técnicas descriptas anteriormente. Las muestras son tratadas con crioprotectores, parcialmente desecadas y luego sometidas a enfriamiento rápido o lento. Generalmente en el precultivo seemplean azúcares (sacarosa, glucosa) y con un tiempo de duración variable desde horas como en el caso de la conservación de embriones maduros de Cocos nucifera, en el cual el precultivo tuvo una duración de 11-20 hs., hasta 7 días como fue aplicado con éxito en embriones somáticos de Elaeis guineensis.

Gotita Congelada: La técnica de la microgota congelada ha sido aplicada con éxito en ápices de Solanum tuberosum, la misma consiste en pretratar (2-3 hs) con DMSO en medio líquido y formar una microgota (2.5 µl) la cual se suspende sobre papel de aluminio y se la lleva a inmersión directa en nitrógeno líquido. Este procedimiento es una adaptación de la técnica clásica desarrollada para meristemas de mandioca.