DESARROLLO TEMATICO: UNIDAD II

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Objetivo Educacional

Conocer el laboratorio, material y equipo mínimo indispensable en la preparación de los medios de cultivo. Conocer las diferentes técnicas de esterilización y su importancia en el cultivo de tejidos vegetales. Conocer las características adecuadas para la selección, manejo del explante para la siembra, así como las condiciones de incubación.

2.1 Medios de cultivo

El cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a partir de la investigación de botánicos y fisiólogos vegetales desde 1950. Actualmente se ha convertido en una herramienta internacional importante en las elección, cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales.

La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigación sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología por las cuales los  microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la producción de microorganismos e identificación. Desde estas dos fuentes provino la tecnología por la cual las plantas u órganos de plantas se pueden multiplicar en gran número, o su crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes en un recipiente estéril.

2. 1. 1. Áreas del laboratorio de cultivo de tejidos

Un laboratorio de cultivo de tejidos se puede dividir esquemáticamente en áreas separadas para las diferentes funciones que se desarrollan en el. Sin embargo, algunas de las funciones pueden desarrollarse en un mismo ambiente.

2.1.1.1 Área de preparación de medios de cultivo y esterilización

Área de preparación: se utiliza principalmente para preparar los medios de cultivo. Este ambiente debe contar con mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colocar las balanzas, el medidor de pH, los platos calientes con agitación, y otros elementos; también debe incluir vitrinas, estanterías y espacio para el equipo de refrigeración, y para la incubadora o la cámara de crecimiento (o para ambas).

Área de lavado y de esterilización: puede estar constituida por dos áreas conectadas entre sí, o por un solo ambiente, y puede estar localizada dentro del área general de preparación.

El área de lavado debe incluir por lo menos un lavadero grande con agua caliente y agua fría y una fuente de agua de alto grado de pureza, preferiblemente agua doblemente destilada; para el efecto se debe usar un destilador de vidrio o de material no toxico y un desionizador de agua colocado entre le destilador y el lavadero.

El área de destilación debe tener espacio para el autoclave vertical u horizontal, el cual puede ser pequeño (olla de presión) o grande (de carga frontal y de enfriamiento lento y rápido), según sea el volumen del material que se procese. Esta área también debe incluir espacio para estufas, secadores y un lavadero con agua caliente y fría.

2.1.1.2 Área de almacenamiento

Esta área debe estar estrechamente conectada con el área de preparación de medios de cultivo en la cual se debe proveer un espacio para almacenar los materiales de vidrio y de plástico y los reactivos químicos. También aquí se debe disponer de un espacio para almacenar agua destilada en botellas de plástico; también debe proveer basureros adecuados para el material vegetal, inorgánico y de vidrio que se deseche.

2.1.1.3 Área de siembra aséptica

En esta área del laboratorio se realiza el trabajo de excisión, inoculación, y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. Dado que este trabajo demanda los más altos niveles de limpieza ambiental, se recomienda la instalación de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado  bajo presión, o la construcción de cuartos de transferencia. Sin embargo, ciertas operaciones de inoculación, como la excisión y el cultivo de ápices y meristemos en tubos de ensayo de boca angosta, se pueden realizar sobre una mesa limpia, ubicada en un lugar del laboratorio libre de corrientes de aire y polvo.

Los gabinetes de flujo laminar deben ubicarse, en lo posible, en un lugar alejado de las puertas y con un mínimo de corriente de aire, con el fin de prolongar la vida útil de los filtros.

2.1.1.4 Área de incubación

Los cultivos se incuban en un cuarto apropiado o en gabinetes o cámaras de crecimiento; estas pueden ser más eficientes en cuanto al control ambiental, pero son más costosas. El área de incubación o crecimiento in vitro debe proporcionar un buen control de la temperatura (20-28 °C), de la iluminación (variable, según las necesidades: 1000 a 5000 lux) y de la humedad relativa (70-80%).

En este cuarto de incubación se instalan estanterías metálicas o de madera para colocar los cultivos. Estas estanterías pueden tener dimensiones variables: el ancho entre 0.3 m 1 m, el largo de acuerdo con el tamaño del cuarto, y la altura total de 1.8 a 2.2 m; la distancia entre peldaños es de 0.2 a .5 m.

Esta área debe incluir, además, un espacio para cultivos en agitación y para cultivos estáticos en la oscuridad.

Es necesario propiciar una buena distribución del aire en este cuarto para evitar zonas de recalentamiento por efecto de la luces. Cuando se utilizan tubos fluorescentes, es conveniente sacar los balastros fuera de este cuarto.

La regulación de la temperatura se puede logra por medio de aparatos de aire acondicionado de pared o de un sistema central. En cualquier caso, es necesario tomar precauciones para evitar el calentamiento excesivo, instalando alarmas y controles para cortar l iluminación cuando falle el aire acondicionado.

Material y equipo: un cuarto con temperatura, iluminación y humedad relativas controladas; estanterías con iluminación para los cultivos, bandejas, termómetros de máxima y mínima,  y gradillas para tubos de varios tamaños.

2. 1. 2. Material y equipo de laboratorio

El laboratorio de cultivo de tejidos vegetales debe contar con el siguiente material, instrumento y equipo:

2.1.2.1 Material de laboratorio

Materiales

Para el desarrollo de la investigación y docencia, en el campo del cultivo de tejidos, se requieren de materiales que permitan la preparación de fórmulas nutrimentales con el objetivo de cultivar tejidos, órganos y células vegetales in vitro.

Cristalería

La cristalería de uso más común para el cultivo de tejidos se selecciona de la que se utiliza en experimentos químicos o de microbiología; sin embargo, poco de este material está diseñado especialmente por investigadores. Se utiliza bastante material de vidrio en la preparación de medio de cultivo y en la siembra de tejidos vegetales. El material que se seleccione deberá ser de alta calidad, resistente a altas temperaturas y a ácidos y no liberar sustancia alguna, especialmente aquélla que es utilizada en la conservación de soluciones madres.

Tubos de Ensayo

Se utilizan muy frecuentemente en cultivos con pequeñas cantidades de soluciones o bien para diversos tipos de medios. En cultivos que se mantienen en rotación o en agitación, para los medios líquidos, se utilizan tubos de ensayo, así como también en los medios sólidos. Los tubos de ensayo utilizados para cultivo de tejidos son más cortos y más anchos. Normalmente las dimensiones de los tubos de ensayo son de 2.0 x 15.0 cm, 2.5 x 15.0 cm o de 2.5 x 9.0 cm, aunque en el cultivo de órganos (experimentos sobre inducción de órganos) a partir del cultivo de tejidos y en la inducción floral se emplean tubos específicos que son de mayor longitud y diámetro (2.5 x 20.0 cm). Para cubrir la boca los tubos de ensayo, una vez que se les ha cultivado, se usan los materiales siguientes: algodón no absorbente, papel aluminio o de poliestireno, poliestireno K-resina, tapas de plástico, tapones de hule y de polipropileno.

Matraces Erlenmeyer

Estos matraces se usan para preparar medios de cultivos sólidos o líquidos; en la preparación de medios de cultivo. Se usan matraces de capacidad de 50, 125, 300 y 500 ml; de 1 y 2 litros dependiendo del volumen de trabajo, se tendrá la cantidad requerida de matraces. Para cultivo en matraces son más fáciles para su manejo los de 50 y 125 ml de capacidad; cuando los matraces y los tubos de ensayo tienen un mismo diámetro, se facilita más el hacer tapones para cubrirlos. Un diámetro de 25 mm es suficiente para operar dentro de ambos. Aunque por supuesto, en el cultivo masivo de tejidos, tanto en medio sólido como líquido, se requieren dimensiones más grandes en los matraces.

Cajas de Petri

Las cajas de petri no sólo se utilizan para hacer cultivos en medios sólidos, también para germinar semillas esterilizadas o bien para esterilizar tapones de hule, filtros de nylon o de acetato de celulosa, que se usa para esterilizar soluciones orgánicas e inorgánicas y para guardar papel filtro.

Comúnmente se utilizan cajas de petri de 6, 9 y 12 cm de diámetro. Para la germinación de semillas son más convenientes las de mayor anchura. Estas cajas de petri deberán tener un ajuste firme entre la tapa y tapa. Generalmente se emplean cajas petri de vidrio, aunque en la actualidad se están fabricando de polipropileno.

Botellas para Cultivo

Para propósitos de cultivar plantas en condiciones in vitro, se utilizan botellas cilíndricas o cuadradas, que pueden ser las botellas de whisky, ron, brandy, etc., que son resistentes a altas temperaturas y que son muy apropiadas para los medios de cultivo sólido. Generalmente tienen una tapa rosca y se les puede conservar fácilmente en una posición vertical u horizontal. Las botellas cuadradas pueden colocarse unas sobre de otras, de tal forma que no ocupen mucho espacio, y las cilíndricas no requieren de canastillas especiales para guardarse. Uno de los recipientes más empleados para el cultivo de tejidos es el frasco para alimento de bebes (Gerber) que aparte de ser útil, es fácil de conseguir, muy barato y no ocupa mucho espacio en la cámara de incubación. En algunas casas comerciales pueden conseguir recipientes de polipropileno o de policarbonato, que además de ser práctico requieren de poco espacio; sin embargo, tienen el inconveniente de tener un costo alto. La condición más favorable es tener el costo más bajo posible tanto en lo referente a investigación, enseñanza y obviamente cuando desarrollamos tecnología para fines comerciales.

Botellas para Reactivos Y Soluciones Madre

Se requieren muchas botellas de polipropileno de 50 ml, 100 ml, 500 ml para guardar soluciones madre o para hacer soluciones de varios reactivos. Las botellas oscuras son usadas para evitar la multiplicación de hongos y bacterias u oxidación causada por la luz. Las botellas de polipropileno como se utilizan para conservar bajo congelación compuestos de composición indefinida, como el agua de coco, soluciones hormonales o compuestos orgánicos termoinestables.

Pipetas, Goteros, Probetas Y Matraces

Para la preparación de diversas soluciones para la elaboración de los medios básicos para el cultivo de tejidos vegetales se requiere de la cristalería siguiente:

            Pipetas graduadas: de 1, 2, 5 y 10 ml

            Goteros con pera de goma de 10 ml

            Probetas graduadas: de 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 ml

            Matraces volumétricos: de 500 y 1000 ml

            Matraces aforados: de 50, 100 y 250 ml

Vasijas de Vidrio para la distribución de Medio de Cultivo

Para la distribución de un volumen de medio de cultivo se pueden usar diferentes formas, por ejemplo vasijas de vidrio, embudos grandes con tubos de hule y pinzas de compresión, columnas de vidrio con boca de salida o botellas de inyección de Linger o simplemente recipientes de aluminio, como jarras. Cuando por alguna razón no se cuenta con los accesorios adecuados para servir el medio de cultivo, como improvisación se usa el embudo grande de vidrio con tubo de hule en el extremo del tallo y pinzas de compresión para controlar el volumen de salida del medio de cultivo.

Jeringas Dispensoras

Cuando son volúmenes pequeños de medios de cultivo es muy efectiva la pipeta automática del tipo Cornwall. Esta pipeta está diseñada especialmente para el traspaso automático de dosis repetida de mediciones exactas y con capacidad para 10 ml.

2.1.2.2 Equipo de laboratorio

Instrumentos y Aparatos

Para el cultivo de tejidos hay pocos aparatos e instrumentos diseñados especialmente para este propósito. Sin embargo, se pueden escoger varios instrumentos médicos, así como también muchos aparatos de microbiología.

Filtros Y Esterilizadores

Para la esterilización del aire y líquidos se emplean filtros especiales. Uno de estos es el cilindro de diatomeas que es usado para líquidos y consta de una abrazadera y un matraz conectado a un extractor. El filtro más famoso es el Seitz y es usado para esterilización del aire del cuarto aséptico, el cual está conectado a una compresora de aire.

Normalmente estos filtros se pueden esterilizar en autoclave a una atmósfera de presión durante 15 min., la esterilización por más tiempo o esterilización seguidas no afecta la membrana. Se sugiere que al utilizar estos filtros de membrana se sigan las recomendaciones indicadas por los fabricantes.

Cámara de Flujo Laminar

Para la realización de investigación y docencia en un laboratorio de cultivo de tejidos se requieren condiciones de asépsia, por lo que se emplea la cámara de flujo laminar que inyecta el aire ultrafiltrado y esterilizado que permita la manipulación de los tejidos sin que se presenten problemas de contaminación por microorganismos como hongos y bacterias, no solamente cuando se hace la inoculación, sino cuando se sirve medio de cultivo a frascos que, por motivos de la técnica, se tengan que esterilizar previamente. De acuerdo al flujo del aire, las cámaras son horizontales o verticales y se tienen tres presentaciones, en cuanto al tamaño; 0.60m, 1.20 m y 1.80m. Algunas veces se encuentran complementadas con llave para gas y para extracción de aire (vacío).

Hornos para Secado

Estos hornos se usan especialmente para el secado del material de vidriería lavado y para la esterilización de instrumentos usados para el cultivo. Para la esterilización por secado, la temperatura que se debe conservar es de 140°C durante 4h o bien a 150°C – 180°C por una hora, por lo que se requiere de un termostato que sea preciso. Sin embargo, la esterilización por este proceso no es recomendable para cristalería de medición de precisión, como probetas, pipetas, debido a que el vidrio sufre dilatación por el calor, lo que altera los volúmenes que se miden.

Las pesadas en seco de células o tejidos cultivados se hacen después del secado al vacío en un horno de vacío. Para este propósito muchas compañías venden eléctricos de vacío con termostato.

Autoclaves

Las autoclaves esterilizan con vapor de presión y tienen dos sistemas de calentamiento: a base de gas o de electricidad. Los modelos de autoclave son de tipo horizontal o vertical.

La esterilización de algodón, gas, papel para envoltura (aluminio, manila), filtros Seitz, millipore, pipetas probetas, matraces aforados, agua y medio de cultivo se hace en autoclave.

Refrigerador y Congelador

Células, tejidos y soluciones madres, se deben de conservar a bajas temperaturas y para ello se requiere un refrigerador. Por otro lado, algunas de las vitaminas o compuestos de composición química indefinida, como el agua de coco, requieren de ser mantenidas en congelación, sobre todo en aquellos lugares de clima cliente. Para experimentos en pequeña escala, un refrigerador común con un pequeño congelar es suficiente.

Balanzas

La preparación del medio requiere de realizar el pesaje con precisión de todos los componentes que lo integran con precisión y de acuerdo al tipo y a la cantidad del constituyente que se agregue al medio, así será el tipo de balanza que se emplee. Existe una gran diversidad de este equipo, sin embargo, hay dos tipos de balanza que son muy usuales en el laboratorio: granatarias y analíticas, ambas de precisión

Torsión o  Granataria

Las balanzas granatarias más frecuentes son:

- De doble y triple barra

- Electrónica con platillos superior

Las balanzas de torsión tienen una capacidad de 100 a 200 g, y sirven para pesar en gramos de sustancias    químicas o células cultivadas. La precisión de 0.1g, es suficiente para estos experimentos.

Balanzas Analíticas

En el mercado se tienen diferentes modelos, sin embargo, por lo menos existen 3 tipos de aparatos:

- De platillo metálico, cuyo sistema de pesaje depende de material de cuarzo

- Electrónica con platillo fijo en el interior del equipo

- Electrónica con el platillo en el exterior del aparato

Estas balanzas tienen una capacidad de 100 a 160g, y una precisión de 0.1mg, lo cual es muy útil para pesar cantidades pequeñas de hormonas, vitaminas y otros microelementos.

Medidores de pH

Para ajustar el pH de los medidores de cultivo se utilizan indicadores de papel y químicos, pero lo más conveniente es usar un potenciómetro con electrodos de vidrio. El potenciómetro no sólo se usa para medir el pH de los medio al prepararse, sino también para medir el pH de los medios durante el período de incubación. Recientemente se usan aparatos con control automático de pH para los cultivos en suspensión.

Destilador

El agua exenta o con una cantidad mínima de metales pesados es una condición primordial en el cultivo de tejidos vegetales, Muchos investigadores utilizan agua bidestilada o tridestilada, hecha en destiladores de vidrio de alta calidad o bien combinado el proceso de destilación por ósmosis inversa y desmineralización. La preparación. La preparación de soluciones madre, medios de cultivo, lavado de cristalería, etc., requiere de grandes cantidades de agua, por lo que es necesario tener un destilador grande de metal, tomando en cuenta que el agua obtenida  así, contiene una pequeña cantidad de iones de metales pesados, condición que afecta el desarrollo de las células en cultivo. Para la obtención de agua también se puede usar un desionizador después de haberse obtenido el agua en un destilador metal.

Adicionalmente, si se necesita agua completamente exenta de sales, se debe redestilar en su destilador de vidrio de alta calidad.

Agitador Magnético

Este es un aparato fundamental para la preparación de los medios de cultivo. Su uso permite la mezcla de los constituyentes del medio durante la elaboración de las soluciones madre o bien en la preparación del medio definitivo. También existen diversos modelos, pero su funcionamiento se limita a dos aspectos, agitar, lo cual permite mezclar el soluto con el solvente y con sistema de calentamiento, lo que facilita la disolución de algunos compuestos que requieren calor para entrar en solución. El número de revoluciones oscila entre 60 hasta 1800 rpm. El número de plazas varía de acuerdo al modelo, pero los hay desde un espacio hasta 6.

Complementariamente, se emplean barras magnéticas que son las encargadas de realizar la agitación de las substancias. Las hay de diferente tamaño y diámetro; con o sin costilla.

2. 1. 3. Generalidades de los medios de cultivo

Debido al incremento de la población mundial, en los últimos años se ha acentuado el interés por la biotecnología vegetal con el propósito de producir alimentos, mejorar cultivares, adaptarlos a diferentes condiciones climáticas y edafológicas y obtener metabolitos de interés comercial (Pérez Ponce, 1998).

En este contexto, el cultivo de tejidos vegetales ha merecido especial atención debido a que comprende un grupo heterogéneo de técnicas que permiten el cultivo en condiciones asépticas de órganos, tejidos o células en un medio de composición química definida e incubados en condiciones ambientales controladas (Roca & Mroginski, 1991; Pérez Ponce, 1998).

Las razones que determinan que el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales constituya una tecnología interesante para la producción de plantas y productos naturales de interés, son las siguientes: 1) la producción de plantas de sanidad controlada, lo que permite incrementos en los rendimientos, 2) la independencia del clima, suelo, distribución geográfica y problemas socio-políticos, 3) la capacidad de establecer un sistema de producción definido, en relación a las demandas del mercado, 4) el cultivo de especies no domesticadas y/o difíciles de cultivar a campo, 5) la conservación del germoplasma de plantas de interés comercial o en vías de extinción, 6) la posibilidad de establecer programas de mejoramiento genético, más rápidos que en los cultivos tradicionales, por técnicas biotecnológicas e ingeniería genética, 7) la producción de compuestos químicos conocidos provenientes de plantas de crecimiento lento o difíciles de obtener por extracción o por síntesis química, 8) la síntesis de nuevos productos químicos expresados únicamente en los cultivos in vitro, 9) la obtención de enzimas y sistemas de biotransformaciones para ser usados solos o combinados con síntesis química y 10) la producción de plantas transgénicas resistentes a patógenos, a herbicidas o a estrés abiótico, con mejor calidad nutricional, que actúen como biorreactores en la producción de proteínas, carbohidratos o lípidos o que secuestren metales pesados de suelos contaminados, entre otras aplicaciones.

2.1.3.1 Definición de medios de cultivo

Un medio de cultivo puede ser definido como una formulación de sales inorgánicas y compuestos orgánicos requeridos para la nutrición y manipulación de los cultivos.

El cultivo de tejidos en su acepción amplia puede ser definido como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos; células desprovistas de pared celular, células, tejidos u órganos) se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. La imprecisión de esta definición puede generar muchas polémicas, pero es actualmente aceptada. Generalmente es común dividir las técnicas del cultivo de tejidos en dos grandes grupos: a) cultivos en medios semisólidos y b) cultivos en medios líquidos, los que a su vez pueden ser agitados (mediante el empleo de agitadores de uso continuo) o estacionarios.

También es frecuente dividir al cultivo de tejidos atendiendo a los niveles de complejidad en cultivo de órganos, cultivos celulares y cultivo de protoplastos. ⁽¹¹⁾

2.1.3.2 Tipos de medios de cultivo

La producción de plantas y de metabolitos puede realizarse mediante cultivos de tejidosvegetales diferenciados o indiferenciados.

a)    Cultivos diferenciados

Los métodos de regeneración de plantas por cultivo in vitro incluyen laembriogénesis somática y la organogénesis.

-       Embriogénesis somática

Los embriones que no resultan de la fusión de gametos se definen como embrionessomáticos, asexuales o adventicios. Son estructuras bipolares con un eje radical-apical,no poseen conexión vascular con el tejido materno y son capaces de crecer y formarplantas normales (Litz&Jarret, 1991; Jiménez González, 1998). La embriogénesissomática se puede obtener directamente a partir de células aisladas o utilizando callos.

Si bien implícitamente todos las células vegetales tienen la información genéticapara formar una planta completa y funcional, se usan comúnmente cotiledones ehipocótilos para producir embriones somáticos (Gómez Kosky, 1998b).

Generalmente se utilizan medios con altas concentraciones de sales, de sacarosao de manitol y se necesita la presencia de una auxina para la iniciación del calloembriogénico, habitualmente 2,4-D. Como la maduración y la germinación de losembriones no ocurren en presencia de esta auxina, se debe remover o usarla en bajasconcentraciones para permitir el desarrollo. Además, tanto la inducción de laembriogénesis somática como el desarrollo de los estados subsiguientes dependen de lapresencia de nitrógeno reducido (Litz&Jarret, 1991).

La maduración comienza después que el embrión completa el proceso dehistodiferenciación, el crecimiento por mitosis se detiene y la célula comienza aexpandirse y a acumular sustancias de reserva. En esta etapa no es necesaria la adiciónde reguladores de crecimiento en el medio de cultivo, aunque en algunas especies serecomienda el uso de citocininas y en otras la adición de ABA (Gómez Kosky, 1998b).

-       Organogénesis

La organogénesis consiste en la formación de un primordio unipolar a partir de una yemay el desarrollo de ese primordio en brotes vegetativos que luego enraizan vía la formacióny proliferación de meristemas radicales. Los brotes pueden formarse directamente delexplanto (organogénesis directa) o indirectamente a partir de callos (Jiménez González,1998).

La organogénesis se desarrolla por inoculación de tejido meristemático estéril(yemas axilares o adventicias) en un medio suplementado con niveles óptimos de sales,de compuestos orgánicos y de reguladores de crecimiento. La calidad y cantidad de loscomponentes del medio dependerá de la especie y del explanto que se quiera cultivar invitro dado que la inducción de un tipo específico de órgano involucra señales aún pococonocidas.

La micropropagación es la tecnología más difundida de propagación masiva deplantas vía organogénesis. Consiste en un conjunto de procedimientos asépticos decultivo de órganos, tejidos o células que permitan la producción de poblaciones deplántulas idénticas a la planta original de la que se derivan (Krikorian, 1991).

Los cultivos diferenciados son más estables genéticamente que los cultivosindiferenciados. A su vez, los cultivos de yemas axilares que provienen de meristemaspreexistentes presentan menores índices de variación genética que el cultivo de yemasadventicias que se originan de novoa partir de tejidos somáticos con desarrollo directo oindirecto a través de la formación de callos (Paniego, 1995; Rice et al., 1992).

b)    Cultivos Indiferenciados

Los cultivos vegetales indiferenciados se obtienen a partir de órganos o tejidosorganizados cultivados en un medio nutritivo apropiado (sólido o líquido) quedesdiferencian ante la presencia de auxinas exógenas. En medio sólido se obtienenmasas celulares más o menos compactas que constituyen los callos, mientras que enmedio líquido se logran las suspensiones celulares formadas por células libres oagregadas. Los cultivos de células vegetales indiferenciadas pueden exhibir una granvariedad estructural, genética y metabólica con respecto a la planta madre.

En los cultivos indiferenciados se encuentran células con gran variedad de tamaños y formas, de citoplasma denso, con vacuolas pequeñas y con alto potencial morfogénico que se pueden homologar a las células meristemáticas de las plantas. También se observan células alargadas y células muy grandes con una gran vacuola central y bajo potencial morfogénico. Sin embargo, debido a que las células en suspensión se dividen en forma asincrónica, los tipos celulares descritos pueden no corresponder a tipos celulares diferentes sino a distintos estadios dentro del ciclo de crecimiento (Warren, 1992), aunque Gómez Kosky (1998a) las clasifica como células meristemáticas, parenquimáticas y gigantes.

A diferencia de los microorganismos, las células vegetales en suspensión en general forman agregados de células individuales de un tamaño ≥ 2 mm. Ello determina una tendencia a la precipitación de los agregados celulares que está influída por la composición química del medio de cultivo, la aireación y la agitación. La adición de pectinasas, la reducción de la concentración de calcio y el aumento de la velocidad de agitación permite reducir la agregación (Scragg, 1992).

c)    Crecimiento de callos y suspensiones celulares

Los cultivos de callos son a menudo de crecimiento lento y heterogéneo, debidofundamentalmente a la disponibilidad vectorial de los nutrientes. Son masas celularescuya morfología raramente provee características que permitan la selección de líneas deinterés (Warren, 1992).

Para evitar la falta de nutrientes, los callos deben ser subcultivados a medio frescoen períodos cortos, variables según la especie (30-45 días). La tasa de crecimiento y lascaracterísticas de friabilidad dependen de la especies, del balance hormonal, de laconcentración de agar, calcio y magnesio y de la intensidad luminosa (Gómez Kosky,1998a).

2. 1. 4. Componentes del medio de cultivo

Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos.Entre ellos encontramos los siguientes:

• Sales inorgánicas
• Fuente de carbohidratos
• Reguladores de crecimiento
• Vitaminas
• Aminoácidos
• Complejos orgánicos
• Reguladores de crecimiento vegetales
• Antioxidantes
• Material de soporte
• Agua

 2.1.4.1 Compuestos inorgánicos

• Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los mismos macro y micronutrientes que son esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general se destacan las concentraciones relativamente altas de nitrógeno y potasio. El nitrógeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato.

También se pueden utilizar urea, glutamina y caseína hidrolizada. Es fundamental que el hierro sea incorporado juntamente con un agente quelante (Na2EDTA), lo que lo hace disponible es un amplio rango de pH.

-       Macronutrimentos:
Son los que se requieren en cantidades de milimoles y son los elementos requeridos en mayor cantidad, (carbono C), oxígeno (O) e hidrógeno (N), aminoácidos, Vitaminas, proteínas y ácidos nucleicos.

Comúnmente se adicionan como nitrato o amonio y menos usual como nitrito. El nitrito se añade en concentraciones de 25-40 milimoles y el amonio de 2 a 20 milimoles (Gamborg y Jerry, 1981) fósforo (P) empleado casi universalmente en forma de fosfatos; sin embargo, la alta concentración de fosfato en solución puede detener el crecimiento, azufre (S) como sulfato y con la posibilidad que se agregue en forma de sulfito o como sulfuro, pero con menos efectividad (Nitsch y Nitsch, 1969). Como fuente de azufre, además de los sulfatos, sulfitos, se encuentran la cisteína, metionina o glutation. La deficiencia de azufre da por resultado una etiolación; magnesio (Mg) es componente fundamental de la molécula de clorofila; el calcio (Ca) es parte importante integral de la membrana celular, además confiere protección a la membrana contra los efectos deletéreos de los metales pesados, salinidad y pH muy bajos; usualmente se adiciona como cloruro de calcio (CaCl2 2H2O)m nitrato de calcio (Ca (NO3)2) y menos comúnmente como fosfato tricálcico ( Ca 3  PO4); fósforo y el potasio como el catión mayor y se adiciona en la forma de KNO3, KI, KCI Y K2 PO4. En términos general fósforo, calcio, magnesio y azufre son requeridos en concentraciones de 1 a 3 milimoles para un buen crecimiento. Sin embargo, existe un antagonismo entre el Ca² y el Mg². Cuando la concentración de Mg²+ es alta, se requiere también alta Ca²+. La concentración comparativa es a menudo más importante que la concentración absoluta de iones.

-       Micronutrimentos:

Los micronutrientes o elementos menores se añaden en concentración micromolar. Los elementos menores son seis, a saber: Fierro (Fe), zinc (Zn), manganeso (Mn), cobre (Cu), cobalto (Co), boro (B) y molibdeno (Mo) que forman parte de la estructura de algunas proteínas vegetales, o vitaminas de interés bioquímico-fisiológico. De los 6 elementos, el Zn, Mn, Fe, Cu y Mo intervienen en la síntesis de la clorofila y en la estructura del cloroplasto (Sundqvist et al, 1980). El manganeso es considerado como uno de los más esenciales, junto con el boro y el fierro; además tiene importancia de la fotosíntesis en donde interviene en la conservación de la ultraestructura de los cloroplastos. De acuerdo a Galston y Hillman (1961), el Mn es un cofactor de las enzimas peroxidasa que permiten la oxidación del ácido indolacético en las células vegetales. Doershug y Miller (1967) mencionan que la omisión reduce el número de brotes en cotiledones de lechuga. Asimismo su adición en alta concentración puede compensar la carencia del Mo en raíz de jitomate (Hannay y Street, 1954). En ocasiones el manganeso puede remplazar al magnesio, en algunos sistemas enzimáticos (Hewitt, 1948).

El zinc, particularmente, participa en el desarrollo normal del sistema radical del jitomate (Eltinge y Reed, 1940). Cobre forma parte de enzimas oxidasas que están involucradas en la oxidación e hidroxidación de compuestos fenólicos, ácido abscísico y dopamina (Lerch, 1981). El fierro y molibdeno juntos forman parte de la estructura de las enzimas nitrogenasa y nitrato reductasa (Lerch, 1981). Algunas veces el Zn se añade con un quelato (EDTA).

El boro tiene su efecto más importante en inducir el crecimiento del tejido diferenciado e indiferenciado. En dicotiledones, la deficiencia de boro frecuentemente permite un aumento en el crecimiento de cambium; asimismo, la deficiencia propicia una depresión de las citocininas lo que trae como consecuencia un incremento en la concentración endógena de las AUXINAS y de tal manera que en un sistema de raíz deficiente de boro, aparentemente hay una inhibición de la raíz por un exceso de auxina (Odhnoff, 1957, Whittington, 1959).

El fierro es requerido para la formación de ácido aminolevulínico y protoporfirinógeno que son precursores temprano y tardío de la clorofila, respectivamente; además es un componente de las proteínas ferredoxinas cuya función es como transportador de electrones en fotosíntesis.

El fierro se usa como FeSO₄ o FeCl₂, pero en valores superiores de pH 5.2 se precipita como Fe(OH)₂, tal como ocurre en el cultivo de raíz de jitomate, ocasionando deficiencia de fierro. En el cultivo de tejidos no se observó deficiencia de Fe, por lo que algunas sustancias, como quelatos pudieron penetrar en las células.

En los inicios de los experimentos del cultivo de tejidos, fue incierta la naturaleza de los microelementos esenciales; sin embargo, Knudson (1922) incorpora el Fe y Mn exitosamente para la germinación de semillas de orquídeas no simbióticas. Otros elementos menores agregados al medio Nobecourt (1937) fueron Cu, Co, Ti, y Be. Heller (1953) observa la deficiencia de los minerales, en callos de zanahoria previamente crecidos en medio Gautheret, causa la muerte del tejido, cuando se hacen 3 a 5 transferencias a un medio sin Fe, B, Mn, Zn o Cu. En el cuadro 1, se presenta la concentración de los componentes, tanto macro como micronutrimentos, de diferentes medios de cultivo.

2.1.4.2 Compuestos orgánicos

• Una fuente de carbono: Prácticamente todos los cultivos son heterótrofos (comparativamente unos pocos son autótrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono.

La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%, es el azúcar más utilizado. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa. También myo-inositol (100 mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos.

• Otros compuestos: Muchas sustancias, de variada composición química, suelen ser adicionadas a los medios básicos. Además de la glicina, otros aminoácidos se pueden agregar a los medios. Es el caso de L-tirosina, asparagina y cisteína, aunque hay que tener presente que en dosis altas pueden inhibir el crecimiento de los cultivos. El carbón activado (0,1 a 5%) suele ser incorporado al medio, dado que es probable que absorba metabolitos tóxicos para los cultivos.

En algunos medios se incorporan ácidos orgánicos como el málico, el cítrico, el pirúvico y el succínico y es frecuente el empleo de L-glutamina y de caseína hidrolizada. Aún hoy se siguen utilizando ciertos componentes de composición química no bien definida como el agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y puré de banana. También en ocasiones es necesaria la incorporación de agentes antioxidantes (L-cisteína, ácido ascórbico, polivinilpirrolidona) para prevenir el ennegrecimiento tisular causado por la oxidación de polifenoles presentes en los explantes. Este ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos.

2.1.4.3 Materiales inertes y gelificantes

• Agente gelificante (en el caso de medios semisólidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el compuesto más utilizado. También pueden emplearse «Agargel» (0,40-0,60%), «Transfergel» (2,0-2,60%), «Phytagel» (0,25- 0,40%), agarosa (0,80-0.90%) y «Gelrite» (0,10-0,20%).(11)

2.1.4.4 Complejos orgánicos

- Sustancias vitamínicas:

Las vitaminas son consideradas como factores alimenticios secundarios requeridos por los animales en pequeñas cantidades. Sin embargo, estas sustancias, que normalmente sintetizan las plantas, son también empleadas por ellas para su crecimiento y diferenciación con papeles catalíticos en el metabolismo. Cuando las células de plantas superiores son cultivadas in vitro , las vitaminas son necesarias para el crecimiento llegando a ser su ausencia o nivel de concentración, un factor limitante. No obstante, estas necesidades dependerán de la especie. Las vitaminas que son adicionadas más usualmente como parte del medio sintético son: tiamina-HCl, ácido nicotítico, piridoxina-HCl, biotina, ácido fólico, ácido pantoténico, riboflavina.

Generalmente, los requerimientos de las células, tejidos u órganos vegetales de vitaminas, son cubiertos por la adición externa, sin embargo, los tejidos pueden obtenerlas a partir de los complejos orgánicos de composición indefinida como en agua de coco, extracto de levadura, jugos de frutas, aguamiel. Aún cuando las plantas in situ son capaces de sintetizar sus propias vitaminas-Butenko (1986) menciona que tejidos de zanahoria pueden llegar a habituarse.

Tiamina (B1): La Tiamina  es esencia para el crecimiento. Es fotoestable, pero durante la esterilización por autoclave se descompone en pirimidina y tiazol; sin embargo, la mayoría de los tejidos son capaces de sintetizar tiamina a partir de los productos de su descomposición. En la naturaleza, especialmente los cereales aparecen libre y en concentraciones relativamente elevada.

Piridoxina (B6): Es termo y fotoestable. Se localiza en semillas de cereales y no se considera esencial para la mayoría de las plantas in vitro.

Quizá el papel más importante en su participación, bien conocida, en la síntesis de purinas y pirimidinas y por lo tanto en el metabolismo de los ácidos nucleicos.

Acido nicotínico: También se le llama niacina. Es foto y termoestable. Su principal función es ser coenzima  de las enzimas que se conoce como deshidrogenasas que catalizan las reacciones de oxido-reducción (NAD, NADP Y NADH o NADPH).

Riboflavina: Es termoestable, pero fácilmente se descompone a la luz. A bajas concentraciones (90.01 mg.l^-l) promueve el crecimiento en callos habituados de zanahoria, pero sin efecto en la oscuridad. Concentraciones de 10-50mg.l^-1  inhiben completamente el crecimiento en la luz y promueve el crecimiento en la oscuridad (Butenko, 1968). La riboflavina aparece en la naturaleza como un constituyente de las flavinas coenzimas: flavinmononucleotido (FMN) y flavin adenina dinucleótida (FDA). La riboflavina es termoestable por lo que no se descompone fácilmente (cuadro 1-3). Galston, Bonner y Baker (1953) señalaron que las diferencias de crecimiento en la luz y oscuridad de brotes blanquiscos o etiolados de chícharo eran causados por la activación del AIA por la riboflavina.

Acidopantotécnico: Es termoestable, por lo tanto, puede ser esterilizado en autoclave junto con el medio nutricional Estimula el crecimiento de levaduras, en sauce llorón y Juniperas (Morel, 1946; Gautheret, 1958). Se encuentra en la naturaleza como componente de la coenzima A. Sin embargo, no es una vitamina esencial.

Biotina: No es esencial y probablemente promueve el crecimiento del cambio en inóculo de sauce llorón (Gautheret, 1959). La biotina sirve como factor de crecimiento de las levaduras y algunas bacterias. Unida a su enzima específica, se relaciona íntimamente con reacciones de carboxilización.

-           carboxilación

-           carboxilación conjugada y transcarboxilación

Acido fólico: No es esencial y se descompone con el calor en soluciones ácidas. En la oscuridad inhibe el crecimiento de los tejidos, mientras que en la luz lo promueve. Reinert y White (1956) mostraron que el ácido fólico inhibe el crecimiento de tejidos de pino. Se considera como vitamina en función de coenzima.

- Aminoácidos

Los aminoácidos representan, para las células, una fuente efectiva e inmediata de nitrógeno, puesto que se pueden incorporar al metabolismo mucho más rápido que el nitrógeno inorgánico, aún cuando ambas fuentes se encuentran en el mismo medio (Thom et al., 1981), sin embargo, su incorporación al medio de cultivo es bastante discutido. Es conocido que su empleo esta en función del balance adecuado de la relación NH4/NO3 que es usualmente suministrado como NO3-, NH4, NO3, NH4Cl, etc. Generalmente la inclusión de estos compuestos nitrogenados orgánicos es necesaria solamente cuando se inicia la formación de callo, se consideran como estimulantes o requeridos  durante la proliferación celular (Gamborg y Jerry 1981). Tienen efecto notable sobre el desarrollo de tejidos vegetales cuando son usados en combinación, mientras que empleando uno solo no se muestra afecto. Alguno tiene efecto antagónico entre ellos, así es el caso de la fenilalamina y tirosina (Anderson, 1976), la leucina y valina, la isoleucina y valina , la arginina y lisina sobre el crecimiento de raíz del embrión de la avena bajo cultivo. En tejido de tabaco el efecto antagónico se observa con la isoleucina, valina y treonina.

Los aminoácidos son usados como constituyentes de compuestos de composición química indefinida o bien por adición directa. De esta manera, se encuentran en caseína hidrolizada, peptona, triptona, lactoalbúmina hidrolizada, extracto de malta, agua de coco, casamina, etc. Los aminoácidos que se emplean directa y más comúnmente son L-glicina, L-glutamina, L-asparagina, L-arginina, L-prolina, ácido glutámico. L-hidroxiprolina, L-alanina, L-lisina, L-leucina, L-serina y L-cisteina. Nitsch y Nitsch (1957) señalan que las formas L de los aminoácidos son más adecuadas para el cultivo de tejidos que las formas -D ya que estas son tóxicas. Además, las formas racémicas son mejores para el desarrollo de tejidos que las formas puras -L de aminoácidos. Se han señalado efectos diferentes al usar isómeros de aminoácidos, por ejemplo: -L alanina es más fácilmente asimilado que la B-alanina. El ácido α aminobutírico no puede ser utilizado como fuente  de nitrógeno, pero puede remplazar completamente a los nitratos.

La inhibición del crecimiento por algunos aminoácidos sólo ocurre por causa de inhibición sintética del nitrato reductasa. Este crecimiento puede ser recuperado usando arginina como el aminoácido desnhibidor, la arginina tiene también efecto de restablecer el crecimiento de raíces inhibidas en compuestas; además de acelerar la formación de yemas en tejidos de tallo de tabaco. La urea también puede ser usada como una fuente de nitrógeno, en vez de aminoácidos. Aún cuando la mayoría de los investigadores señalan que si el medio de cultivo tiene la fuente de amonio o nitrato adecuado, los aminoácidos no son esenciales (Gamborg, et. al.,1976). También es cierto que la adición posiblemente depende del origen del tejido; además de que su incorporación es requerida para diversos objetivos. De acuerdo con Steward y Caplin (1951), la glicina o mezcla de aminoácidos en forma de caseína hidrolizada se requieren para el mantenimiento de células indiferenciados (callo). Murashige y Skoog (1962) Gamborg (1966) señalan que la adición de la caseína hidrolizada incrementa la división celular en tabaco, frijol y maíz, respectivamente. 

A pesar de que la presencia de nitrógeno orgánico es muy importante para la organogénesis, se considera esencial para la embriogénesis. Además de la caseína hidrolizada, la L-glutamina ha demostrado ser promotor del desarrollo embrionario. En ocasiones, puede sustituir a la caseína hidrolizada (Litz, 1982). Filner (1978) indica que en células XD de tabaco, el nitrógeno orgánico, particularmente la arginina actúa positivamente en la síntesis de proteínas. En embriones inmaduros de vainilla, el aceleramiento de la maduración es estimulada por la adición al medio de sulfato de adenina y L-glutamina (Parra y González, 1989 y González et. al. 1990)

Es difícil definir si el papel de los aminoácidos es esencia o no; sin embargo, la adición de la caseína hidrolizada puede prevenir o inclusive asegurar la fuente de nitrógeno, ante la posible deficiencia de la fuente de amonio o nitrogeno inorgánico o como Li et. al., (1989) señala que la ausencia de aminoácidos, principalmente prolina, ocasiona degeneración de plántulas de Pachystachyslutea cultivadas in vitro.

- Carbohidratos

La sacarosa y la glucosa se utilizan en el cultivo de tejidos de muchas especies. La fructuosa, maltosa, celabiosa, rafinosa y otras, se les usa como fuente de carbono para algunas variedades de tejidos. Para la mayoría de los tejidos en cultivo es sacarosa la mejor fuente de carbohidratos (2-5%), de manera que el máximo aumento en peso fresco en los tejidos cultivados del endospermo del sorgo se obtiene con 2% de sacarosa, y el máximo de peso seco a 8%. Varios informes señalan que la sacarosa se hidroliza activamene a fructuosa y glucosa por la invertasa de la pared celular. Así por ejemplo, la sacarosa, callosidades de zanahoria, desaparece del medio de cultivo en dos días. La dextrina, pectina y almidón son aprovechados por la callosidades de Sequoia y el almidón soluble es aprovechado por callosidades del endospermo del maíz o de Juniperus. Las carbohidrasas hidrolizan el almidón, maltosa o rafinosa en monosacáridos.

La combinación de algunos carbohidratos no son útiles para el crecimiento de tejidos vegetales como fuente única de carbono. Los ácidos orgánicos más efectivos, como el ácido succínico, ácido cítrico y ácido fumárico, desarrollan sólo de un 25 a 50% del crecimiento comparado con un tejido cultivado en el cual la fuente de carbono es la sacarosa Bouriquet (1958) sugiere que los ácidos orgánicos actúan sinergéticamente a bajas concentraciones del 2,4-D.

- Reguladores del crecimiento

Los reguladores de crecimiento se dividen en auxinas, citocininas, giberelinas y retardantes e inhibidores del crecimiento y son naturales y sintéticas.

Auxinas naturales

De acuerdo con su naturaleza, el ácido indolacético (AIA) es la única auxina natural que se localiza en las zonas de crecimiento. Tiene la peculiaridad de ser descompuesto por la luz, por lo que no es conveniente utilizarlo en cultivo en suspensión. Por ser hormona natural, su desaparición del tejido es muy rápido ya que en las plantas se encuentran las enzimas oxidasas de la que hidrolizan a la hormona de manera que su efecto es suave y de poca duración.

Auxinas sintéticas

Son auxinas sintéticas del ácido naftalenacético (ANA), ácido 2,4 diclorofenoxiacético y ácido indolbutírico (AIB). La primera y la tercera hormona forman parte de los productos que se utilizan como enrizadores.

Los tejidos aislados de plantas y las callosidades en subcultivos, requieren de auxinas. Los que no las requieren son los callos habituados y los tejidos tumorales. Para el cultivo de callosidades se usan de 0.1 a 5.0 mg/l de AIAy para la diferenciación de órganos se ha señalado a menudo que es necesario reducir la concentración de la auxina. El AIA o el ANA son mejores que el 2,4-D para la inducción de la organizacióncelular. Si se usa 2,4-D en muchas especies de plantas trendrán la tendencia a la formación de callos, por lo que si se desea inducir la formación de órganos, se necesita cambiar el 2,4-D por otra auxina como el AIA o bien bajar la conentración.

Citocininas

Citocininas naturales son: Zetina que se extrae del endospermo del maíz y 6 issopentanil adenina (2iP) que se aisla de ClostridiumTumerfaciens que produce un sobre crecimiento de los tejidos. Algunos tipos de tejidos requieren esencialmente citocininas, principalmente en el fenómeno de la organogénesis; por ejemplo, los callos de soya o de la médula de tabaco (var Wisconsin #38). Sin embargo, no todos los tejidos requieren citocininas, aunque algunas crecen bien en su presencia, éstas no son esenciales.

Citocininas sintéticas son: 6-benciladenina (6 BA) o también conocida como bencilanimopurina (6 BAP); la cinetina (K) también conocida como 6-furfiril aminopurina (FAP). La 6-benciladenina se utiliza en concentraciones de 1.01-1.0 mg/l. También se emplea la zeatina o isopentil adenina como sustancias de naturaleza citocinética.

Acidogiberélico

El ácido giberélico no se usa conúnmente para el cultivo de callo. En ocasiones se adiciona al medio para inducir alargamiento del tallo, pero no es común su uso.

Acidos nucleicos y compuestos con base de ácidos nucleicos:

El ADN, ADN hirolizado no tiene efecto en tejidos bajo cultivo, pero el ERN estimula el crecimiento de callos de tabaco, maravilla y Rumex el efecto del ARN puede ser demostrado en presencia de citocinas.

El uracilo, citosina, guanina, xantina y timina no son efectivos para los callos de zanahoria. Sin embargo, la cinetina y el extracto de zanahoria, que tiene actividad de citocinina, tienen el efecto de estimular el crecimiento cuando se usan con una mezcla de aminoácidos. Por otro lado, la guanina, timina y citosina inducen la formación de organos en tejidos de tabaco. La mezcla de una citocinina y ácido orótico induce el desarrollo de la inflorecencia de Plumbago índica.

2. 1. 5. Preparación y manejo de soluciones stock

Las soluciones Stock: son soluciones de cada uno de los compuestos constituyentes de los medios de cultivo (nitratos, sulfatos, halógenos, etc.) a una elevada concentración, lo cual facilita el manejo y la preparación de medios de cultivo a bajas concentraciones, de dichos compuestos.

Método de las 4 soluciones

1. Preparación de una solución stock de macronutrientes MS x10 (solución 1)

Para obtener un litro de dicha solución llénese un erlenmeyer de 1 l con 500 ml de agua destilada. A continuación añádase cada uno de sus componentes (Tabla 1) disolviéndolo totalmente antes de añadir el siguiente:

Substancia	Peso (en gramos)
NH4NO3	16,5
KNO3	19,0
CaCl2·2H2O	4,4
MgSO4·7H2O	3,7
KH2PO4	1,7

Para finalizar, bastará con verter el contenido en una probeta de 1 l, enrasar con agua destilada, trasladar la solución a su recipiente definitivo y agitarlo.

Esta solución debe guardarse a 4 ºC.

2. Preparación de una solución stock de micronutrientes MS x 100 (solución 2)

Para obtener un litro de dicha solución llenar un erlenmeyer de 1 l con 500 ml de agua destilada. A continuación añadir cada uno de sus componentes (Tabla 2) disolviéndolo totalmente antes de añadir el siguiente.

Substancia	Peso (en mg)
MnSO4·4H2O	2.230,0
ZnSO4·7H2O	860,0
H3BO3	620,0
KI	83,0
Na2MoO4·2H2O	25,0
CuSO4·5H2O	2,5
CoCl2·6H2O	2,5

Para terminar, proceder del mismo modo que con la solución stock de macronutrientes. Esta solución también debe almacenarse a 4 ºC.

3. Preparación de una solución stock de hierro MS x 200 (solución 3)

Para obtener 100 ml de dicha solución deben seguirse los pasos siguientes:

- Calentar unos 50 ml de agua destilada en un agitador magnético preparado para tal propósito.

- Cuando el agua esté templada, añadir 556 mg de FeSO₄·7H₂O.

- Una vez se haya disuelto el producto anterior, agregar 744 mg de Na₂EDTA·H₂O.

- A continuación, añadir 1 lenteja de NaOH.

Ya disueltos todos los elementos, verter el contenido en una probeta de 100 ml, enrasar, trasladar la solución a su envase definitivo y etiquetar debidamente.

Esta solución se almacena a 4 ºC.

4. Preparación de una solución stock de vitaminas y inositol MS x 200  (solución 4)

Para obtener 100 ml de dicha solución llenar un erlenmeyer con unos 50 ml de agua destilada y añadir uno a uno, hasta total disolución los siguientes componenetes:

Substancia	Peso (en mg)
Mio-inositol	2.000
Ácido nicotínico	10
Piridoxina·HCl	10
Tiamina·HCl	2
Glicina	40

A continuación, verter el contenido en una probeta de 100 ml, enrasar, llenar el recipiente definitivo con la solución y etiquetarlo.

La solución stock de vitaminas debe almacenarse a -20 ºC.

2. 1. 6. Preparación de los medios de cultivo

Existen diversos procedimientos utilizados en la preparación de medios de cultivo. A continuación se describe de forma resumida la manera de preparar un medio de cultivo MS, para 250 ml.

Como primer paso se realizan los cálculos conocer las cantidades necesarias de cada una de las soluciones Stock, de sacarosa y de Phytagel, para la preparación de los medios de cultivo, para 250 ml.

Para lo cual se necesitan 5 ml de nitratos y 2.5 ml de los demás compuestos (soluciones stock).

Se pesan 7.5 g de sacarosa  y 0.7 g de Phytagel.

Después se vierten cada una de las cantidades de las soluciones Stock a un vaso de precipitado utilizando una probeta de 10ml, se mezclan con una pipeta y se afora con agua destilada hasta los 250 ml. Después se agrega la sacarosa y se disuelve. Posteriormente se procede a medir el pH (si hay necesidad se debe corregir el pH a 5.6). Luego se coloca la solución en la parrilla de calentamiento hasta alcanzar una temperatura de 78°C, e irle agregando paulatinamente el phytagel para lograr una mejor disolución. Se deja en ebullición durante 2 minutos, después se retira y se coloca sobre una superficie limpia. Finalmente se vierte en partes iguales en frascos ámbar (cerrados herméticamente) para guardarlos en el refrigerador a 4 °C.

2. 2. Esterilización

La esterilización es un proceso donde se efectúa la destrucción o muerte de los microorganismos en general, desde los protozoos pasando por los hongos y bacterias hasta los virus. Se dice que un elemento es estéril cuando está libre de cualquier tipo de vida.

2.2.1 Generalidades

Se han  desarrollado  y  aplicado  diversos procesos de desinfección  y  esterilización para limitar o eliminar la presencia de microorganismos. La esterilización es un método de eliminación total de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que elimina únicamente formas vegetativas de los microorganismos.

2.2.2 Definición

Esterilización es el proceso por el cual se matan o se eliminan los microorganismos, de materiales o superficies por la aplicación de un agente químico o físico.

2. 2.3 Tipos de esterilización

La esterilización puede ser utilizando los siguientes métodos:

1. Físicos

- Radiaciones: con luz UV, rayos gamma; (para esterilizar cámaras de flujo y áreas del laboratorio).

- Filtración: mediante filtros millipore (para esterilizar fitohormonas)

- Calor seco: a 170 °C por 1 hora (para esterilizar estufas, cristalería, pinzas, bisturí, etc.).

- Fuego directo: Con calentamiento al rojo blanco con mechero (para esterilizar pinzas, mangos de bisturí, etc.).

- Calor húmedo: utilizando autoclaves (para esterilizar medios de cultivo, agua, entre otros).

2. Químicos

          a) Gases: Óxido de etileno, Óxido de propileno, Formaldehído, bromuro de metilo, ácido peracético, ozono, betapropiolactona, vapores de peróxido de hidrógeno

           b) Líquidos: glutaraldehído, Iodóforos, alcohol.

2.2.4   Factores que intervienen en el proceso de esterilización

Uno de los principales problemas que sepresentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminación de los mismos con diversos tipos de microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus).

El ambiente generado por explante-medio de cultivo-condiciones físicas de incubaciónes altamente propicio para la proliferación de muchos de estos microorganismos que pueden provocar la destrucción de los cultivos. Esdifícil cuantificar el impacto de estas pérdidas, pero en promedio, en laboratorios dedicados a la micropropagación se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los nutrientes del medio de cultivo o bien lo modifican.

Es muy difícil conseguir cultivos estrictamenteasépticos dado que en la mayoría de los casos es altamente probable que los mismos contengan virus y fitoplasmas, por lo que en la práctica, cuando se refiere a cultivos asépticos, en general se quiere significar que son cultivos donde no se produce la proliferaciónde hongos y bacterias.

Dos son las fuentes de contaminaciones: a)microorganismos presentes en el interior o enla superficie de los explantes y b) fallas en losprocedimientos de cultivo en el laboratorio.

2.2.5 Esterilización con calor húmedo

La esterilización con calor húmedo con vaporbajo presión (en autoclave o en una «olla apresión»). Es el procedimiento más empleadopara la esterilización de los medios de cultivo(salvo, como se indicó más arriba, para aquellosque posean componentes termolábiles).

En este caso, lo más común es usar una presiónde 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, conlo que prácticamente se destruyen todas las formas de vida. Es importante que en todos los puntos del autoclave se alcance dicha temperatura,  para lo cual hay disponibles cintas detectoras colorimétricas.

Nota: para medios de cultivo de 20-25 ml se recomienda a 121 °C; 15 P.S.I (1.2 kg/cm²) por 15 minutos.

2.2.6 Esterilización de material de cristalería y otros materiales

La esterilización en estufas mediante calor seco (aire caliente) es recomendable para esterilizarrecipientes de vidrios secos (pipetas, cápsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4 horas en estufas a 180-200 ºC brindan excelentesresultados.

La mesa de trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el área del aire estéril.

Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminación, porque es recomendable que, antes decomenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabón y se desinfecten con etanol al 70 %. La utilización de guarda polvos, guantes y máscaras protectorasde la boca y de la nariz, así como los gorros protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminación. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cápsulas de Petri) deben ser resterilizados antes de su uso. Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanolal 95% y, antes de ser usados, se deben flamear cuidadosamente en la llama de un mechero.También es necesario flamear la boca de los recipientes que contienen los medios de cultivo antes y después de cultivar el explante.

2.2.7 Esterilización de medios de cultivo

A continuación se presenta una tabla sobre la esterilización de medios de cultivo utilizando autoclave a 121 °C:

Volumen de la solución	Tiempo requerido para la esterilización
75 ml	20 min
250 ml	25 min
500 ml	30 min
1000 ml	35 min
1500 40	40 min
2000 45	45 min

2.3. Establecimiento del Cultivo De Tejidos

Para el establecimiento de los cultivos utilizando cualquiera de los sistemas es necesario tener en cuenta algunos aspectos generales comunes relacionados conel explante, la asepsia, el medio de cultivo y las condiciones de incubación.

2.3.1. Etapas del cultivo de tejidos

Las etapas o fases del cultivo de tejidos vegetales incluye las siguientes:

-       Fase 0: la cual se refiere a la selección de plantas donadoras de explantes. A demás de también, en esta fase se puede incluir el cultivo de las mismas en condiciones controladas.

-       Fase 1: Establecimiento del cultivo aséptico in vitro.

-       Fase 2: Multiplicación de brotes in vitro.

-       Fase 3: Enraizamiento in vitro.

-       Fase 4: Adaptación al campo.

2.3.1.1 Establecimiento aséptico

Una vez escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantos.

Antes de extraer los explantos se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.

Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantos del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo de cultivo.

2.3.1.2 Multiplicación

Los nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar

2.3.1.3 Enraizamiento

Para enraizar los explantos se utilizan principalmente dos métodos:

- Enraizamiento in vitro

Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar y como la fuente de energía para enraizar está en el medio de cultivo no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis.

- Enraizamiento ex vitro

Los explantos se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita.
Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía paraenraizar y desarrollarse.

Los explantos deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el laboratorio, o ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en un área sombreada.

2.3.1.4 Adaptación

Tanto si los explantos fueron enraizados in vitro como ex vitro, están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos explantos han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas perezosos para responder al descenso de la humedad relativa, demasiado lentos para para evitar la desecación del explanto. Por otra parte crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula cérea bien desarrollada.

Los explantos deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz.

2.3.2 Selección de plantas madres

Se debe realizar una adecuada preparación de la planta dadora de explantes, cultivándola preferentemente en invernaderos tratadas conproductos químicos que eliminen patógenos y eventuales microorganismos endófitos.

2.3.2.1 Genotipo

El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfogénicos, desde la capacidad del explante para su establecimiento encondiciones in vitro a la proliferación de callo, o la diferenciación y crecimiento de nuevos órganos. Por esta causa, no es posible generalizar metodologías o protocolos de trabajo debido aque los medios de cultivo, así como las condicionesde cultivo seleccionados, deben ser específicos para cada situación en particular.

2.3.2.2 Fitosanidad

En los casos en que se utilicen plántulas crecidas in vitro como plantas donantes de explantes, es necesario desinfectar las semillas para su cultivo y germinación y luego es aconsejable desinfectar también las plántulas resultantes.

En algunos materiales vegetales se utiliza la preincubación de los explantes mediante lo cual éstos son desinfectados suavemente y precultivados durante 24 horas en un medio conteniendo sacarosa, y finalmente son desinfectados nuevamente y cultivados.

De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas donadoras que crecen en condiciones de invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminación. Por otra parte, es recomendable evitar el uso de «explantes sucios» (raíces, rizomas) que provienen de plantas crecidas en macetas o en el campo, dado que en la mayoría de los casos no es posible conseguir una buena desinfección de los mismos.

2.3.2.3 Edad de la planta

Por lo general, se recomienda que las plantas donadoras de explantes sean jóvenes, con ramas dehiscentes (sin letargo, sin dormancia). Plantas que se encuentren generalmente en la etapa vegetativa, en la cual se obtiene el mayor desarrollo de yemas y/o brotes vegetativos.

2.3.2.4 Condiciones de crecimiento de la planta

El tratamiento de la planta madre, las condiciones físicas y fisiológicas en las que ésta se encuentre y el sector del cual se tome el explante determinarán a su vez la respuesta morfogénica en condiciones in vitro.

Como se menciono anteriormente, las condiciones de crecimiento de la planta madre, deben ser controladas en cuanto a su manejo fitosanitario, nutrición, control medio ambiental (temperatura, humedad relativa, luz, etc.), que le permita un buen desarrollo vegetativo.

2.3.2.5 Edad del órgano o tejido vegetal

Este es un aspecto degran influencia en la morfogénesis. Como regla general se puede decir que cuando más joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor será su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemos apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies.

En el caso de la micropropagación de plantas leñosas, la edad del explante es un factor crítico. Si los tejidos son jóvenes, la micropropagación tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas donantes de explantes.

2.3.3. Explante

El termino explante se define como un fragmento de una planta (célula, tejido u órgano; el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrión, nudo, semilla, antera, etc.), que se escinde y se prepara de forma aséptica para su cultivo en un medio nutritivo.

La elección de un explante apropiado constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos; en primera instancia, dicha elección está determinada por el objetivo perseguido y la especie vegetal utilizada.

2.3.3.1 Tipo de explante

De acuerdo con el objetivo del cultivo de tejidos vegetales, el tipo de explante para cada caso es diferente.

• Estudios básicos. En este caso, los explantescultivados pueden ser diversos. Si lo único que se quiere lograr es un sistema de callos para estudiar algún proceso fisiológico, se puede cultivar cualquier órgano, tejido o célula viva.

• Obtención de plantas con sanidad controlada.Es muy común la utilización del cultivo de tejidos para la obtención de plantas libres de virus. El explante ideal para ello es el meristemo (dependiendo de la especie, de0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios foliares.

• Micropropagación. En este caso dependerádel sistema que se quiere utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotación de meristemas, los ápices terminales y los segmentos uninodales de ramas jóvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivadorde tejidos debe conocer perfectamente labiología de la reproducción de la planta para aprovechar aquellos explantes que en forma natural son propágulos. En cambio, si se pretende micropropagar mediante el empleo desemillas sintéticas elexplante original deberá posibilitar la inducción de la embriogénesis somática. En este caso, la utilización de embriones zigóticos inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes.

• Obtención de híbridos interespecíficos. Una de las primeras aplicaciones del cultivo detejidos en la agricultura lo constituyó su empleo como ayuda para la obtención de híbridos derivados de cruzamientos interespecíficos, donde se produce el aborto temprano de embriones.En estos casos, el explante cultivado es el embrión cigótico en estadios tempranos de su desarrollo. Con la misma finalidad también seutilizan ovarios u óvulos fecundados.

• Obtención de plantas de semillas con embrionesrudimentarios. Para esta finalidad los explantes pueden ser semillas (por ej. orquídeas) o bien, se aíslan los embriones en un estado temprano de desarrollo («corazón») como en el caso de yerba mate o de algunas variedadesde duraznero.

• Obtención de plantas haploides (considerando como haploide a un esporofito que contiene el complemento gamético de cromosomas). En este caso, los explantes más utilizados son las anteras, aunque también pueden emplearse microsporas aisladas, óvulos y ovarios no fertilizados.

• Inducción de variación somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero si la finalidad de su utilización es la aplicación en planes de mejoramiento genético de plantas, los explantes utilizados deben posibilitar la regeneración de plantas enteras.

• Producción y/o conversión de sustanciasútiles. Se puede utilizar una gran variedadde explantes. Los de raíces suelen ser muyutilizados.

• Obtención de híbridos somáticos. Para esta finalidad se recurre a la fusión de protoplastos. En la mayoría de los casos se aíslan los protoplastos de mesófilos de hojas y de suspensionescelulares.

• Conservación e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los explantes        preferidos para el desarrollo de sistemas deconservación a mediano y largo plazo (crío conservación con nitrógeno líquido) y para elintercambio de material genético.

• Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los cultivosa partir de explantes extraídos de semillas en germinación (hipocótilo, epicótilo, cotiledones, raíces).

2.3.3.2 Posición del explante en la planta

Es aconsejable seleccionar el explante según el objetivo que se persigue, de las partes más suculentas, verdes, y mejor adaptadas en la planta madre, es decir, se deben elegir los brotes del tercio superior de una rama, en la cual se presenta el mayor crecimiento y diferenciación celular.

2.3.3.3 Tamaño del explante

En general, cuanto más grande sea el explante mayores serán las posibilidades de inducir la proliferación de callos o la regeneración directa de órganos. Sin embargo,a mayor tamaño de explante también son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. También es necesario tener en cuenta que existe un tamaño mínimo del explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fácil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeños suelen requerir del empleo de medios más complejos o de los denominados medios acondicionados.

2.3.4. Siembra del explante

La siembra del explante se debe realizar en una cámara detransferencia con aire estéril («gabinete de flujolaminar»), localizada en un ambiente limpioy no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV enforma directa).

2.3.4.1 Desinfección del explante

Se debe realizar la desinfección superficial delos explantes mediante el uso de compuestos químicos con el objeto de eliminar los microorganismoscon el menor daño posible para el explante. Si bien no es posible recomendar un procedimiento general, se puede señalar que el procedimiento más popularizado consiste en una doble desinfección mediante lainmersión de los explantes en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipocloritode sodio 1 -3%, contenido en el agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza del explante. Algunos procedimientos se basan en el empleo de únicamente etanol o de hipoclorito de sodio. Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada estéril.

2.3.4.2 Diseccion del explante

La disección del explante se debe realizar utilizando pinzas y bisturí previamente esterilizados, para evitar toda forma de contaminación debido a su uso.

2.3.4.3 Siembra de diferentes medios: sólidos y líquidos

Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio de cultivo. Puede emplearse como semi-sólido o líquido. El agente gelificante más utilizado en el cultivo invitro es el agar, extraído de diversas algas marinas.

Las diferentes calidades existentes en el mercado modifican la expresión morfogénica debido a que pueden contener sustancias inhibitoriaso promotoras del crecimiento.

En caso de seleccionar medios de cultivo líquidos, la respuesta morfogénica observada varía de manera considerable. El cultivo líquido es imprescindible cuando se busca promover la morfogénesis indirecta a través de suspensiones celulares. Para ello es necesario cultivar los callos en medio líquido con agitación para permitir que las células se disgreguen y puedan diferenciar raíces, brotes o embriones somáticos en forma aislada.

La elección de un medio de cultivo líquido o sólido depende, además, de la especie con laque se trabaja.

En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo  del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.).

El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando la propagación invitro es desarrollada a travésde las siguientes vías:

- Inducción de embriogénesis.

- Cultivo de protoplastos.

- Cultivo de suspensiones celulares.

2.3.5. Condiciones de incubación

La incubación de los cultivos se debe llevara cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperiodo, humedad atmosférica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor) y una buena y uniforme circulación de aire en el interior y dotados de un buen sistema de alarma para cortar la iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 ºC, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo «luz día» con una irradiación de entre 50 y 200μmol m-2s-1. La humedad atmosférica debe ser elevada (80- 90%).

Durante el período de incubación, los cultivos son expuestos a condiciones ambientales disímiles al ambiente externo. La atmósfera interna se caracteriza por presentar una considerable variación diurna en la concentración de CO2, humedad relativa elevada, temperatura constante e intensidad lumínica baja. A su vez, el medio de cultivo compuesto por concentraciones elevadas de azúcares (en aquellos sistemas heterótrofos y semiautótrofos de micropropagación), sales y reguladores del crecimiento, sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfológicas, anatómicasy fisiológicas que las plantas deberán corregir cuando son transferidas al ambiente externo. Este período de adaptación al nuevo hábitat es llamado fase o etapa de aclimatación.

2.3.5.1 Fotoperiodo

El fotoperíodo habitualmente utilizado es de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, aunque algunos cultivos requieren oscuridad (Marín, 1993).

2.3.5.2 Intensidad lumínica

El comportamiento de muchos cultivos depende de la calidad, intensidad y fotoperíodo de la luz que reciben, dado que varias enzimas involucradas en el desarrolloy en el metabolismo secundario son influenciadas por la luz. La mayoría de los cultivos se desarrollan a una intensidad luminosa entre 5 a 25 W/m2 (1000 a 5000 lux). Si bien lacalidad de la luz puede determinar diferentes respuestas morfogénicas, en general se utiliza luz blanca, pobre en longitudes de onda larga.

2.3.5.3 Temperatura

La temperatura de las cámaras de cultivo se regula en general entre 22 y 28°C, permitiendo así el desarrollo tanto de especies de climas templados como de plantas tropicales. Es de destacar que durante el período iluminado, la temperatura en el interiorde los frascos de cultivo es 1-2°C superior a la de la cámara, debido al efecto invernadero; se crea así un termo-período suave (Marín, 1993).

La velocidad de síntesis y de degradación de distintos compuestos y por ende el nivel de producción y acumulación de metabolitos también es influenciado por la temperatura (Mantell& Smith, 1983).

2.3.5.4 Humedad relativa

En cuanto a la humedad relativa, ésta se mantiene en alrededor del 70 % en las condiciones en las que se realizan habitualmente los cultivos, aunque varía con la temperatura de la cámara y el tipo y cierre de los recipientes. El porcentaje de humedad relativa no es reportado en la mayoría de los trabajos sobre cultivo in vitro de vegetales (George, 1987a).

2.3.6. Cambios fisiológicos del explante

El retraso en el desarrollo de la cutícula y la escasa funcionalidad del aparato estomático que presentan las hojas de la mayoría de las especies cultivadas in vitro, determinan una alta tasa de transpiración que puede ocasionar la muerte por deshidratación. El control de este proceso fisiológico es de vital importancia durante la aclimatación, teniendo en cuenta que la disminución de la transpiración será gradual y dependerá de la rehabilitación de los estomas, así como también del desarrollo de la cutícula.

Los principales cambios fisiológicos que se presentan en el explante son los siguientes:

- los estomas no son funcionales, es decir se encuentran atrofiados.

- la cutícula es delgada y presenta aberturas.

- el parénquima empalizada no se encuentra firmemente unido.

- Las raíces son delgadas, en poca cantidad

2.3.6.1 Formación del callo

El callo se define como una masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro (disco de hoja, meristema, células en suspensión, etc.)

- Es posible regenerar brotes o vástagos a partir de estos callos.

- Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala. La composición salina más empleada para inducir la formación de callo, la organogénesis directa o indirecta en la mayoría de las especies vegetales, es la de Murashige & Skoog (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseñadas para inducir determinados patrones morfogénicos

2.3.6.2 Crecimiento de yemas adventicias

Las yemas adventicias (yemas formadas de novo) tienen una mayor tasa de
variación somaclonal en cultivo. En general la formación de brotes adventicios puede conducir a tasas muy elevadas de multiplicación, mas altas que los que se obtienen de ramas axilares. Por otra parte, los brotes adventicios pueden aumentar las tasas de producción de plantas aberrantes, resultantes de la partición de quimeras que en algunos cultivares resulta en la perdida de la variegacion y en reversiones a una condición más juvenil, cuando se use este sistema las plantas producidas deben evaluarse cuidadosamente respecto a la posible variación. Las diferentes plantas pueden responder en un modo distinto a las diversas citoquininas y auxinas a parte debido a su control hormonal natural. Una secuencia apropiada de hormonas es de importancia particular en cuanto que una hormona puede tener un efecto inductor pero debe estar ausente o en cantidad reducida para que crezca el órgano.

2.3.6.3 Enraizamiento

En esta etapa las plántulas deberán tener el tercer par de hojas desarrolladas y se colocan en una solución enraizadora durante 12 horas en oscuridad total a fin de inducir la formación de raíces. Después de estetratamiento se colocan en eras con sustrato a basede estopa de coco molida y suelo. Las eras se cubrencon plástico por un período de dos meses.

2.3.6.4 Preadaptación y trasplante

La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deberá contemplar el control minucioso de los parámetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratación y, al mismo tiempo, estimular la fotosíntesis con el objeto de generar un rápido crecimiento de los plantines.

El equipamiento necesario estará sujeto a la especie, pudiendo utilizarse desde túneles de polietileno para plantas que posean un elevado control de la transpiración (por ej. Maluspumilao Agave tequilana) o bien, a través del empleo de cámaras climatizadas equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino de la humedad relativa. En algunos casos puede resultar necesaria la aplicación exógena de ABA (hormona involucrada en el control del cierre de los estomas) o bien, el empleo de sustancias antitranspirantes que forman una capa semipermeable en la superficie de la hoja. En este último caso deberán tomarse algunas precauciones debido a que pueden observarse reacciones de fitotoxicidad.

Resulta imprescindible evitar la exposición atemperaturas extremas tanto en la fase aéreacomo en el substrato. Mediante el empleo de extractores y/o acondicionadores de aire combinados con un sistema de niebla, es posible establecer la temperatura de la fase gaseosa entre los 25 y 30 ºC durante la estación estival, mientras que en la época invernal es necesario,a veces, el empleo de mantas térmicas o serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel del substrato, para mantener la temperaturapor encima de los 18-20 ºC. Sin lugar a dudas, la opción más económica es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia (20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado («saram»). No obstante, en aquellas latitudes donde el nivel medio deluz natural es bajo y los días son cortos durante una parte considerable del año, la luz artificial puede ser aplicada como complemento de la luz natural. Las lámparas tubulares fluorescentes del tipo «luz día» son empleadas en horticultura para prolongar el fotoperíodo. Asimismo, las lámparas tubulares de sodio alta presión presentan una distribución espectral de la energía adecuada para estimular fotosíntesisy se emplean para tal fin en una amplia variedad de cultivos.

2.3.7. Trasplante al sustrato

Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la elección del substrato, siendo el adecuado aquel que permita el normal crecimiento y desarrollo de las raíces.

2.3.7.1 Tipos de sustrato

Se puede emplear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mezclas de ellos, teniendo la precaución de realizar una esterilización previa. Es conveniente el agregado de fertilizantes, sea a través del substrato (fertilizantes de liberación controlada) o bien mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); empleándose proporciones ricas en fósforo (N-P-K: 9-45-15) y potasio(N-P-K: 4-25-35) que favorecerán el desarrollo radicular y la rustificación de las plantas.

2.3.7.2 Desinfección o esterilización del sustrato

En todo momento deberá realizarse un riguroso control fitosanitario empleándose antibióticos, fungicidas e insecticidas de uso universal.

2.3.7.3 Trasplante y adaptación bajo condiciones de invernadero

Después de la fase de aclimatación las plantitas son trasplantadas en bolsas de polietileno con sustrato adecuado que permite el buen desarrollo de las plantas. Este proceso dura de 7a 9 meses, después de este período está listas para ser sembradas encampo definitivo.

2.3.7.4 Manejo del material trasplantado

Para el trasplante se debe lavar y desinfectar la raíz de la planta para evitar que se propaguen hongos por residuos del medio de cultivo.

A veces se recomienda en alguna plantas realizar el corte de raíces y que sean estas trasplantadas utilizando enraizador (hormonas de crecimiento radicular).

Se recomienda la seguir el siguiente cuadro de manejo:

Factor de manejo	Semana 1	Semana 2	Semana 3	Semana 4
Luz	80% sombra	60% sombra	50% sombra	30% sombra
H. R.	Alta; uso de nebulizadores, cámara húmeda, bolsas, etc.	Disminuir paulatinamente la nebulización	Disminuir la nebulización	Evitar la nebulización. Se eliminan las bolsas.
Riego (agua)	Agregar solución MS al 50% en el riego.	Evitar la solución MS.	Evitar la solución MS.	Evitar la solución MS.
Sustrato	Peat-mos; aireación, drenaje, etc.

Bibliografía consultada

1.http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge. pdf

2. http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/CultivoTejidos.pdf

3. http://www.uaa.mx/investigacion/revista/archivo/revista20/Articulo%207.pdf

4. http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo1.pdf

5. http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo3_parte1.pdf

6. http://histolii.ugr.es/jmgarcia/cultivos/cultivos.pdf

7.http://www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/agbt/teoricos/2011_2%20Cultivo%20de%2

0Tejidos%20I.pdf

8. http://www.uprm.edu/biology/profs/rios/labman.pdf

9. http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo2.pdf

10.http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material%20Didactico/Microbiolog%C3%ADa%20ambiental/II.%20TecMic-Esterilizaci%C3%B3n.pdf

11. http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/Manual%20c%20in%20v.pdf

12. http://www.uaemex.mx/fciencias/archivos/Biotecnologia_vegetal.pdf

13. http://www.rac.es/ficheros/doc/00323.pdf

14.http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/images/file/ClaseProcariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%201%20T%C3%A9cnica%20as%C3%A9ptica.pdf